腫瘤PET分子探針3-O-(2-18F-氟乙基)-L-多巴的合成及初步生物學評價

馬晶鑫，伍 洲，姜申德，王紅亮,3，武志芳,3

(1.山西醫科大學第一醫院 核醫學科，山西 太原 030001；2.天津大學 藥物科學與技術學院，天津 300072；3.山西省分子影像精準診療協同創新中心，山西 太原 030001)

18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-Fluorodeoxyglucose,18F-FDG)是目前正電子發射斷層顯像(positron emission tomography, PET)常用的一種糖代謝型顯像劑，但存在特異性差、腦腫瘤檢出率低、腫瘤與炎癥的鑒別診斷假陽性或假陰性等問題[1-2]。氨基酸代謝類腫瘤PET顯像劑是18F-FDG在臨床腫瘤PET顯像應用中的重要補充[3]。O-(2-18F-氟代乙基)-L-酪氨酸(18F-FET)是目前臨床上常用的腦腫瘤PET顯像劑[4-5]。6-18F-氟-L-多巴(18F-FDOPA)是腦腫瘤及神經系統等疾病的較理想顯像劑，經過方法改進、新型標記前體的研發及手性相轉移催化法的應用，18F-FDOPA的合成越來越簡單，但仍存在合成時間長、前體制備復雜、副產物多、對設備條件要求較高等諸多問題[6]。因此，本研究以多巴為原料，向其芳香環上直接引入帶有易離去基團的碳鏈，采用同18F-FET類似的親核取代反應實現18F標記，合成一種新型18F標記的多巴衍生物3-O-(2-18F-氟乙基)-L-多巴(3-O-(2-18F-fluoroethyl)-L-DOPA,18F-FEDOPA)。并通過體內生物分布及腫瘤PET顯像評價其作為一種新型的氨基酸代謝類腫瘤PET顯像劑的可行性。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

回旋加速器(HM-10型)：日本住友公司產品；Micro-PET/CT掃描儀(IRIS, Inviscan)：法國Inviscan公司產品；核磁共振波譜儀(AV300 MHz)：德國Bruker公司產品；高效液相色譜系統(HPLC)(Series Ⅲ型，Lab Alliance)：美國Lab Alliance公司產品，配有B-FC-3600型高能放射性檢測器(美國Bioscan公司產品)和201型紫外檢測儀(美國Lab Alliance公司產品)；C18分析型色譜柱(5 μm, 250 mm×4.6 mm)：英國GRACE/Hichrom公司產品；C18半制備型色譜柱(5 μm, 250 mm×10 mm)：日本YMC公司產品；全自動雙探頭放射免疫γ計數器(SN-697型)：上海核所日環光電儀器有限公司產品；Sep Pak QMA小柱：美國Waters公司產品。

1.2 主要材料與試劑

4，7，13，16，21，24-六氧-二氮雙環[8.8.8]二十六烷(Kryptofix 2.2.2，K2.2.2)：法國ABX公司產品；無水乙腈(CH3CN)、無水碳酸鉀(K2CO3)：美國Sigma-Aldrich公司產品；其余試劑均為國產分析純或化學純；實驗用水為去離子純化水；瘤株：纖維肉瘤(S180)和肝癌(H22)細胞株：購于上海細胞庫。

1.3 實驗動物

健康美國癌癥研究所(institute of cancer research, ICR)小白鼠25只，雌雄不限，20～25 g，清潔級，山西醫科大學實驗動物中心提供。許可證號：SCXK(晉)2015-0001。

1.4 實驗條件

1.4.1HPLC色譜條件 分析：C18分析型色譜柱，流動相為乙腈(A)和水(B)的混合液(體積比為1∶9)，流速為1 mL/min，紫外(UV)波長為254 nm。分離純化：C18半制備型色譜柱，流動相為乙腈(A)+水(B)混合液，流速為3 mL/min，流動相中乙腈(A)的梯度條件為0～1 min：10%；1～20 min：10%～80%；20～25 min：80%～10%。

1.4.21H NMR條件 以氘代氯仿(CDCl3)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內標。

2 實驗方法

2.1 前體化合物合成

前體化合物的合成路線示于圖1。以L-多巴(L-DOPA)為原料，在甲醇及氯化亞砜參與下發生甲酯化反應，得到化合物2(L-DOPA甲酯)；在四氫呋喃(THF)中，使用2.1倍當量的二碳酸二叔丁酯(Boc2O)對化合物2的α-氨基和4-羥基進行保護，得到化合物3；將化合物3加入丙酮溶劑中，由K2CO3和18-冠-6共同催化，與乙二醇二對甲苯磺酸酯反應，得到前體化合物4(N-叔丁氧羰基-(3-O-甲苯磺酸酯乙基-4-O-叔丁氧羰基)-L-多巴甲酯)。另外，為了獲取參比化合物3-O-(2-[19F]氟乙基)-L-多巴([19F]FEDOPA)，在K2CO3和18-冠-6共同催化下，化合物3在丙酮溶劑中與2-氟代乙醇對甲苯磺酸酯反應，得到未脫BOC保護的參比化合物5。

2.2 18F-FEDOPA的放化合成

18F-FEDOPA的合成路線示于圖2。1) 加速器產出的18F-經Sep Pak QMA柱捕獲，用1.5 mL K2.2.2/K2CO3水溶液將18F-洗脫至反應瓶中。2) 110 ℃下通入氮氣，吹干，加入2 mL CH3CN再次共沸蒸干。3) 向反應瓶內加入8～9 mg前體化合物4(1 mL CH3CN溶解)，110 ℃油浴中密封反應15 min。4) 反應結束后使用半制備型HPLC分離純化，收集放射性保留時間tR=12.5 min的產品至蒸餾瓶。5) 將收集的溶液于40 ℃下旋蒸除去溶劑后，加入4 mol/L HCl水溶液(0.3 mL)，110 ℃下密封加熱20 min后，使用0.6 mL 2 mol/L NaOH水溶液中和，加入注射用水稀釋后過濾膜待用。

圖1 18F-FEDOPA前體化合物的合成路線Fig.1 Synthesis of the precursors of 18F-FEDOPA

圖2 18F-FEDOPA的放化合成Fig.2 Synthesis of 18F-FEDOPA

2.3 質量控制及體外穩定性檢測

2.3.1質量控制 用精密pH試紙測定18F-FEDOPA注射液的pH。用帶有放射性檢測器的分析型HPLC測定化合物5、18F--洗脫液、18F-5以及18F-FEDOPA的保留時間和放化純度。

2.3.2體外穩定性檢測 將18F-FEDOPA溶液室溫靜置，于標記后0、60、120、240 min按上述HPLC分析條件測定放化純度。

2.4 體內生物分布

健康ICR小鼠4組，每組3只，腹腔注射0.2 mL的3.6%的水合氯醛溶液進行麻醉。尾靜脈注射18F-FEDOPA(0.2 mL，1.85 MBq)。注射后于10、30、60、90 min時，眼靜脈取血后斷頸處死，解剖取心、腦、肝、腎、肺、腸、肌肉及骨等組織臟器，分別測定各組織的質量與放射性計數，計算每克組織衰減校正后的百分注射劑量率(%ID/g)。

2.5 腫瘤模型制備

將H22肝癌細胞和S180肉瘤細胞株用滅菌生理鹽水配制成1×107mL的濃度, 接種于正常ICR小鼠腹腔，每只小鼠腹腔注射0.2 mL，1周后待其腹腔充盈后抽取腹水待用。取ICR小鼠若干只，在其肢體左、右側皮下同時分別植入H22和S180小鼠肉瘤腹水(0.2 mL，腫瘤細胞數約6(105mL)，1周后待腫瘤生長至直徑約0.8～1.0 cm時使用。

2.6 PET/CT顯像

荷H22、S180腫瘤ICR小鼠3組，每組3只，腹腔注射0.2 mL的3.6%的水合氯醛溶液進行麻醉。第一組經尾靜脈注射18F-FEDOPA(0.2 mL，3.7 MBq)后立即行PET動態掃描，總采集時間90 min。圖像預處理：將每10 min采集的數據分割為一幀，共9幀。圖像重建采用基于蒙特卡羅系統模型的3D OSEM(ordered subsets expectation maximization)算法。先行PET采集后再行CT掃描。CT圖像重建采用Feldkamp濾波反投影算法，并執行射束硬化校正及環形偽影校正。圖像分析采用PMOD軟件(PMOD Technologies LLC, Zurich, Switzerland)進行，勾畫出腫瘤、心臟、腦、肌肉等感興趣區域 (volume of interest, VOI)，并導出時間活度曲線(time-activity curve, TAC)。第二、三組小鼠分別注射18F-FDG(0.2 mL，3.7 MBq)和18F-FEDOPA(0.2 mL，3.7 MBq)，于注射60 min后均行10 min的PET靜態掃描和CT掃描，并進行圖像重建以及對各感興趣組織的定量分析，確定每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)，并計算腫瘤與非腫瘤組織的放射性攝取比(T/NT)。

3 結果與討論

3.1 化學合成

參照18F-FET合成方法，設計合成了18F-FEDOPA新的前體化合物4。在L-多巴分子苯環的3-羥基處引入一個帶有易離去基團的碳鏈，既便于通過親核反應實現18F標記，又能有效保留多巴分子的α氨基和羧基的完整結構。

18F-FEDOPA前體化合物4以L-多巴為原料，制備過程均為常見化學反應：化合物2制備為常規酸催化甲酯化反應；化合物3的制備根據其分子結構中的α-氨基，以及苯環上3和4-羥基的反應活性的不同，使用適量的二碳酸二叔丁酯為保護試劑，得到了叔丁氧羰基對α-氨基和苯環上4-羥基選擇性保護的化合物3；前體化合物4的合成在堿性條件下使用乙二醇二對甲苯磺酸酯對3-OH烷基醚化的反應。另外，為便于對18F-FEDOPA的放化合成過程進行有效監控及產品確認，使用了制備化合物4相同的條件，由化合物3與化合物2-氟代乙醇對甲苯磺酸酯經醚化反應，得到18F-FEDOPA未經脫出BOC保護的參比化合物5。化合物3、4、5經核磁鑒定后，確定了結構的正確性。

化合物3：淡黃色油狀物(8.02 g,76.2%)，1H NMR(CDCl3):1.424(s,9H,N-Boc-CH3),1.556(s,9H,O-Boc-CH3),3.013-3.026(m,2H,DOPA-CH2),3.707(s,3H,OCH3),4.542-4.557(m,1H,DOPA-CH),5.021(d,J=7.9 Hz,1H, DOPA-NH),6.654(d,J=8.2 Hz,1H,6-ArH),6.776(d(br),1H,2-ArH),7.083(d,J=8.2 Hz,1H,5-ArH)。

化合物5：黃色油狀液體(0.43 g,76.7%)，產率76.7 %;1H NMR(CDCl3):1.423(s,9H,N-Boc-CH3),1.548(s,9H,O-Boc-CH3),3.060(dq,J=6.1 Hz,J=14 Hz,2H,DOPA-CH2),3.711(s,3H,OCH3),4.235-4.276(m,2H,CH2-O-Ar),4.580(dd,J=6.3 Hz,J=13.7 Hz,1H,DOPA-CH),4.714(d,AA′BB′,J=48 Hz,2H,CH2-F),4.982(d,J=8.0 Hz,1H,DOPA-NH),6.725-6.756(m,2H,ArH),7.050(d,J=8.1 Hz,1H,5-ArH)。

3.2 18F-FEDOPA的制備

3.3 質量控制

圖3 放射性(a、b、d)和紫外(c)HPLC圖譜Fig.3 Radioactivity (a, b, d) and UV (c) HPLC chromatograms

前體化合物4經18F-氟化反應后進行Radio-HPLC分析(圖3a)：18F-的保留時間為2.8 min，18F-5的保留時間為14.3 min；經半制備柱HPLC分離純化后，將18F-5與化合物5同時經Radio(圖3b)-UV(圖3c)HPLC分析顯示，兩者保留時間均為14.3 min，證明18F-5結構的正確性。然后經4 mol/L HCl加熱后得到目標產品18F-FEDOPA，Radio-HPLC保留時間為4.5 min(圖3d)，放化純度為99%。分析過程中發現，在酸性條件下，產品在HPLC中的保留時間較長，中和至中性到弱堿性，產品保留時間則稍有前移(保留時間提前約0.5 min)。可能在堿性條件下，18F-FEDOPA的羧基會以羧酸鹽的形式存在，分子結構帶有負電荷，分子的極性增大，18F-FEDOPA在反相的C18柱上滯留性稍降低。在中性或酸性條件下，則是羧酸的形式，呈電中性，在C18柱上的滯留性較在堿性條件下滯留性增加。18F-FEDOPA注射液為無色澄清溶液，pH約6～7。室溫下0、60、120、240 min的放化純度分別為：98.65%、98.58%、97.98%、97.49%，4 h內放化純度沒有明顯降低，均大于95%，表明其穩定性良好。

3.4 體內生物分布

圖4 18F-FEDOPA的健康小鼠體內生物分布Fig.4 The biodistribution in healthy mice of 18F-FEDOPA

18F-FEDOPA在健康小鼠體內的生物分布結果示于圖4。由圖4結果可見，18F-FEDOPA主要通過腎臟代謝，注射后10、30、60、90 min時的腎臟放射性攝取率分別為(4.50±0.54)、(3.62±0.53)、(2.76±0.36)、(1.33±0.25)%ID/g。血液放射性隨時間增加逐漸降低，90 min時即降至(0.50±0.09)%ID/g。骨骼的攝取值無明顯增加，說明其在體內未發生脫氟，體內穩定性良好。心臟和腦組織的放射性攝取明顯低于其他組織，且隨時間增加未見明顯增大，60 min時的攝取值分別為(1.01±0.18)、(0.90±0.24)%ID/g，與大部分氨基酸顯像劑的分布特性相似，具備良好的藥代動力學特性[7-9]。

3.5 PET/CT顯像

本研究成功制備了S180纖維肉瘤-H22肝癌一體模型，并完成了18F-FEDOPA 90 min動態PET/CT顯像。注射18F-FEDOPA 10 min后即出現腫瘤顯影，隨時間增加，體內放射性迅速清除，腫瘤顯示更加明顯。TAC曲線示于圖5，H22和S180腫瘤均有較明顯的顯像劑攝取，且10 min后H22相對較高。腫瘤攝取值隨時間逐漸增加，60 min時達到峰值：H22為(6.375±1.025) %ID/g，S180為(5.152±0.853) %ID/g，90 min時仍有明顯蓄積。心臟、腎臟內放射性清除較快，其余臟器攝取值均不高，腦組織最低，且隨時間推移無明顯變化，與生物分布結果一致。

圖5 18F-FEDOPA在腫瘤及臟器中的時間-放射性攝取率曲線Fig.5 Time activity curves of 18F-FEDOPA in tumors and organs

荷瘤小鼠分別注射18F-FEDOPA和18F-FDG 60 min時的PET/CT融合圖像示于圖6。由圖6結果可見，腫瘤組織清晰顯影，與18F-FDG相比，18F-FEDOPA的本底整體明顯較低(以腦和心臟部位為著)，腫瘤顯影更加清晰。18F-FEDOPA和18F-FDG在注射60 min時動物腫瘤與非腫瘤組織的放射性攝取比(T/NT)結果示于圖7，18F-FEDOPA的腫瘤與心、腦的比值較18F-FDG高(H22/腦：7.73±2.10>2.14±0.71，S180/腦：4.62±1.52>2.14±0.71；H22/心：4.33±1.22>1.89±0.25，S180/心：2.59±0.30>1.56±0.30，P<0.05)，腫瘤與肌肉比值無明顯差異。18F-FEDOPA作為一種多巴衍生物仍屬小分子氨基酸化合物，能夠通過血腦屏障。然而正常腦組織獲取能量最主要的物質是葡萄糖[10]，與18F-FDG相比，多種氨基酸類顯像劑在腦組織中的攝取較低，在腦腫瘤顯像方面更具優勢[11-12]。鑒于本研究中18F-FEDOPA較低的腦攝取和較高的腫瘤與腦的比值，18F-FEDOPA在腦腫瘤顯像方面可能有潛在的應用價值。

a——注射18F-FEDOPA 60 min時S180(左)和H22(右)的PET/CT融合圖像b——注射18F-FDG 60 min時S180(左)和H22(右)的PET/CT融合圖像圖6 荷瘤小鼠microPET/CT顯像a——PET/CT imaging of S180 (left) and H22 (right) at 60 min post-injection of 18F-FEDOPA b——PET/CT imaging of S180 (left) and H22 (right) at 60 min post-injection of 18F-FDGFig.6 microPET/CT imaging of S180-H22 tumor-bearing mice

圖7 注射18F-FEDOPA和18F-FDG 60 min時的腫瘤與非腫瘤組織放射性攝取比(T/NT)Fig.7 The tumor to normal tissue ratio (T/NT) at 60min post-injection of 18F-FEDOPA and 18F-FDG

與18F-FDOPA在黑色素瘤小鼠模型體內的分布結果相比[13]，模型小鼠注射18F-FEDOPA 60 min后的正常組織整體攝取值高于18F-FDOPA，但腫瘤與心、腦的T/NT都較高，提示18F-FEDOPA具備18F-FDOPA類似的診斷效能。相比于18F-FET在結腸癌小鼠的分布結果[14]：模型小鼠注射18F-FEDOPA 60 min后的生物分布特點與18F-FET相似，大部分臟器的攝取值均偏低，以心臟和腦為著，提示18F-FEDOPA整體本底更低，更有助于腫瘤顯示。綜合分析，與18F-FDOPA和18F-FET相似，作為氨基酸的一種衍生物，18F-FEDOPA有良好藥代動力學特征，且在腫瘤PET顯像方面具有很大潛能。

4 結論

本研究使用新型前體化合物N-叔丁氧羰基-(3-O-甲苯磺酸酯乙基-4-O-叔丁氧羰基)-L-多巴甲酯，經兩步法成功標記合成了3-O-(2-18F-氟乙基)-L-多巴(18F-FEDOPA)，其結構與18F-FDOPA和18F-FET類似，合成過程簡單，放化產率高，穩定性良好。通過健康小鼠體內生物分布實驗及S180纖維肉瘤和H22肝癌模型小鼠的PET/CT顯像發現，18F-FEDOPA主要通過腎臟排泄，在兩種類型腫瘤組織中均有較高的攝取，而在心臟和腦組織的攝取較低。18F-FEDOPA有望成為一種新型的氨基酸代謝類腫瘤PET顯像劑，但其細胞攝取機制及代謝特征需要進一步研究。