18F-DCFPyL的制備和初步臨床應用

張曉軍，付華平，李云鋼，劉 健，何玉林，劉亞超，徐白萱，朱 虹，吳 江，崔孟超，張錦明

(1.中國人民解放軍總醫院 核醫學科，北京 100853；2.內蒙古醫科大學附屬醫院 核醫學科，內蒙古 呼和浩特 010050；3.南京軍區南京總醫院 核醫學科，江蘇 南京 210002；4.北京師范大學 放射性藥物重點實驗室，北京 100875)

流行病學研究發現，近二十年我國男性前列腺癌發生率顯著上升，一方面由于生活方式的改變和環境因素的惡化導致癌癥發生率提高，另一方面，人們防癌意識的增強和健康檢查的普及使前列腺癌患者的檢出率增高，尤其是影像學技術的快速發展使早期前列腺癌的檢出率極大提高[1]。前列腺特異性膜抗原(prostate-specifc membrane antigen, PSMA)又稱谷氨酸羧肽酶，在正常前列腺以及前列腺增生細胞表面有所表達，在絕大多數前列腺癌細胞中明顯上調，是前列腺癌特異性分子標志。放射性核素標記的PSMA小分子抑制劑在前列腺癌檢查和治療評價方面均展現出較大的臨床應用價值[2]。基于藥效基團谷氨酸-脲-賴氨酸(Glu-urea-Lys)，68Ga-PSMA-11是第一個谷氨酸尿素類小分子PET顯像劑，具有良好的生物學分布特征，常在臨床研究中作為對比探針，驗證其他PSMA類分子探針的有效性[3-6]。但螯合劑HBED-CC無法連接治療核素如177Lu或225Ac，且核素68Ga由發生器獲取，半衰期短，68Ga具有較高的正電子能量使PET圖像信噪比較低，其臨床應用受到一定限制。18F是臨床應用最廣泛的正電子核素，18F-DCFPyL(2-(3-{1-羧基-5-[(6-[18F]氟-吡啶-3-羰基)-胺基]-戊基}-脲基)-戊二酸)也是基于Glu-urea-Lys結構開發的PSMA特異小分子顯像劑，具有親和力高，體內藥代動力學良好的特征，臨床對比發現其各項性能優于68Ga-PSMA-11[7-9]。本研究利用國產氟多功能模塊，對比不同的中間體水解方法，建立可靠、穩定的18F-DCFPyL自動化合成方法，并進行生物學分布和安全性評價，經初步臨床應用，獲得18F-DCFPyL人體分布特征。

1 材料與設備

1.1 實驗材料

1.2 實驗設備

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊(配Alltech 626泵，Grace Alltima (10 mm×250 mm) C-18 柱)：派特(北京)科技有限公司；便攜式內毒素快速檢測儀：美國Charles River公司；分析型HPLC檢測儀(配515泵，2487紫外檢測器，Phenomenex Gemini C-18分析柱(5 μ，100 ?，4.6 mm×150 mm)，BioScan流動放射性檢測器)：美國Waters公司；Hidex Automatic Gamma Counter：芬蘭Hidex公司；Biography truepoint 64 PET/CT掃描儀：德國西門子公司；GC 7890型氣相色譜儀和SS420X 工作站：上海天美公司；GHL-300型氫氣發生器：北京匯佳精儀公司。

1.3 實驗動物

正常雄性NIH小鼠20只，6～8周齡，(20±5) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2015-0001。

1.4 患者

該研究已通過中國人民解放軍總醫院倫理委員會審查。

一例入選者來自中國人民解放軍總醫院泌尿外科門診病人，69歲，前列腺癌切除術后5個月生化復發患者1例，血清總PSA(total prostate-specific antigen, tPSA)為1.86 ng/mL，游離PSA(free prostate-specific antigen, fPSA)為0.106 ng/mL。

2 實驗方法

2.1 18F-DCFPyL的制備條件

利用氟多功能模塊，18F-DCFPyL注射液的制備主要經由以下步驟。合成路線示于圖2。

(1) 無水18F-的制備。加速器經18O(p, n)18F反應得到18F-，由N2氣體載帶至QMA柱(QMA柱預先以10 mL 0.075 mol/L TBAHC和10 mL純水活化)，0.9 mL淋洗液(0.3 mL 0.075 mol/L TBAHC和0.6 mL乙腈)將18F-淋洗至反應管，通入N2并加熱至116 ℃將液體除干，2 mL無水乙腈分三次加入反應管并分別蒸干，得到無水18F-。

(2) 親核反應。冷卻反應管至40 ℃，加入3號瓶中溶于0.5 mL無水乙腈的5 mg(6.25 μmol)前體，通入N2混勻后加熱至50 ℃，反應5 min。

(3) 水解反應。上述步驟相同，進行三組實驗，分別使用三種酸水解中間體，分別是0.4 mL 85% H3PO4、1 mL 12 mol/L HCl和0.5 mL 57% HI，加入后均50 ℃加熱10 min。

(4) HPLC分離純化。水解后加入1 mL 2 mol/L NaOH中和，再加入2 mL流動相溶液稀釋，利用HPLC分離，流動相為10%乙腈水溶液，含0.1% 三氟乙酸，流速為4 mL/min，待產品放射性峰出現，收集產品至13號中轉瓶(預裝50 mL純水)。

(5) 固相萃取。將液體通過C18萃取小柱至廢液，再用20 mL注射用水清洗C18柱并吹干，最后以1.5 mL無水乙醇將18F-DCFPyL淋洗至無菌真空瓶，加入無菌注射用水稀釋至乙醇濃度低于10%，得到18F-DCFPyL注射液。

2.2 18F-DCFPyL的質量控制

產品質量控制主要包括性狀觀察、pH測量、核素鑒定、產品鑒定、放化純度測量、比活度測量、穩定性測量、內毒素含量檢測和有機溶劑殘留檢測。在鉛玻璃后觀察注射液性狀；以精密pH試紙測量；通過半衰期檢測法鑒定核素；以碘鉑酸試紙檢測法半定量K2.2.2含量；利用分析型HPLC，流動相為18% 乙醇水溶液，含0.2% H3PO4，流速為1 mL/min，紫外波長254 nm，將產品溶液與標準品19F-DCFPyL共進樣鑒定產品；放化純度、比活度和穩定性均通過分析型HPLC測量計算得到；利用快速內毒素檢測儀測量內毒素含量；利用氣相色譜檢測有機溶劑殘留。

2.3 18F-DCFPyL的生物安全性評價

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL的18F-DCFPyL(采用H3PO4水解方法制備，以下實驗均相同，比活度為89 GBq/μmol，濃度為555 MBq/mL，載體濃度為5 μg/mL，乙醇濃度為7.5%)，合計放射性為111 MBq/只，載體為50 μg/kg。觀察注射后小鼠的反應，并稱重；另一組(5只)經尾靜脈注射0.2 mL 7.5%乙醇溶液作為對照。飼養、觀察1周后稱重并處死，解剖，取主要器官做病理檢查。

圖1 18F-DCFPyL自動化合成模塊Fig.1 The module of auto-synthesis for 18F-DCFPyL

圖2 18F-DCFPyL的合成路線Fig.2 Radiosynthesis of 18F-DCFPyL

2.4 正常NIH小鼠體內分布實驗

取正常NIH雄性小鼠15只，利用隨機數字表分為3組，每組5只，18F-DCFPyL產品經注射用水稀釋后，經尾靜脈每只注射1.85 MBq(0.2 mL，載體為0.083 μg)18F-DCFPyL，分別于注射后30、60、90 min脫頸處死，解剖并取血液、心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉和骨，稱重后置于Hidex Automatic Gamma Counter自動計數并衰減校正，計算不同時間點組織的放射性攝取值(%ID/g)。

2.5 臨床PET顯像

一例前列腺癌術后生化復發患者，為確定下一步治療方案，需確認是否發生臨床復發，并判斷屬局部復發或區域淋巴結轉移或遠處轉移，擬行18F-DCFPyL PET/CT檢查。患者經常規臨床評估和實驗室檢驗，并簽署知情同意書后，由靜脈按3.70 MBq/kg(0.033 μg/kg)注射18F-DCFPyL，靜脈注射后60 min行全身PET/CT靜態顯像[8]。PET圖像采用三維采集模式進行全身掃描，采集完成利用CT數據對PET圖像進行衰減校正。PET圖像重建采用OSEM，CT重建采用標準重建法。以ROI技術勾畫感興趣區域并計算SUVmax。

3 結果與討論

3.1 18F-DCFPyL的制備

本研究利用PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊進行自動化合成，氟化反應以四丁基銨碳酸氫酯為相轉移催化劑，可得到較高的親核效率，而以K2.2.2為相轉移催化劑，以K2CO3為堿時氟化效率降低[11]。盡管第一步氟化反應效率較高，但中間體的三個保護基團-叔丁基酯難以水解。本研究對比了三種強酸水解中間體，由于中間體含脲基和酰胺鍵，高溫強酸下易斷裂而發生副反應，并且為了避免手性碳發生構型翻轉，水解均在溫和條件下進行。85% H3PO4、12 mol/L HCl和57% HI均能較好的水解中間體，最后得到的不校正放化產率分別為17.1%、16.9%和18.4%。而在實際應用中，酸液從4號試劑瓶轉移至反應管時，由于85% H3PO4粘度較大，較多H3PO4液體殘留在試劑瓶、管線和反應管壁而無法進入反應管底參與水解反應，使水解效率下降，若另引入微量(0.1 mL)乙腈清洗試劑瓶，可以較好的解決該問題；濃鹽酸粘度低，易于加入反應管，也能較好的水解叔丁基酯，但濃鹽酸極易揮發，腐蝕性大，對合成設備的管線和電磁閥體可能造成損害；57% HI常用于制備11CH3I，其加入反應管后，50 ℃加熱時可將管壁殘留的HI回流至管底，能穩定的水解中間體，在18F-DCFPyL合成完畢，以大量的乙醇清洗反應瓶、管線和反應管，可有效保護設備，因此以HI為水解試劑具有較好的實際應用價值。以10%乙腈水溶液(含0.1% TFA)為流動相，18F-保留時間為3 min，18F-DCFPyL的保留時間為10～12 min，相對應可見紫外吸收峰(圖3)。由于未脫保護的中間體脂溶性大，該流動相無法洗脫中間體，若更換純乙腈可洗脫大量未水解中間體，約為50%～60%(未校正)，可見這三種酸均無法完全水解中間體，若更換強堿水解中間體，會導致副反應的發生，因此，效率更高、副反應少的水解方法仍待進一步研究。

3.2 18F-DCFPyL的質量控制

三種水解方法得到的18F-DCFPyL均進行質量控制。注射液呈無色澄清，pH為5～7，核素半衰期為(112±2) min，產品與標準品共進分析型HPLC，二者相對保留時間一致(圖3)，放化純度大于98%，比活度為54～90 GBq/μmol，產品在4 h后放化純度仍大于95%，內毒素含量低于5 Eu/mL，乙腈含量低于0.01%，K2.2.2含量低于50 μg/mL，注射液質量符合臨床用藥標準(依據2015版《中國藥典》)。

3.3 18F-DCFPyL的生物安全性評價

注射18F-DCFPyL后NIH小鼠無任何異常表現，1周內無死亡發生，小鼠注射藥物前體重為(20.5±2.4) g，一周后體重為(22.8±2.1) g，對照組注射前與注射后一周的體重分別為(20.9±1.7)g和(23.2±2.2)g，其體重變化程度與對照組無差別，主要器官病理切片檢查無異常。按千克體重計算，小鼠注射劑量為5.55 GBq/kg，載體劑量為50 μg/kg。正常人檢查劑量為370 MBq/65 kg/0.67 mL的18F-DCFPyL，比活度為5.55 MBq/kg，載體劑量為0.05 μg/kg(絕對量為3.25 μg)。此時，小鼠的放射性劑量約為人的注射劑量放射性1 000倍，化學載體近1 000倍，可見該藥物安全可靠。

3.4 正常NIH小鼠體內分布實驗

18F-DCFPyL在正常NIH小鼠體內分布示于圖4。18F-DCFPyL從血中清除很快，30 min攝取值為(1.18±0.12)%ID/g；主要經泌尿系統排泄，腎臟攝取值高，且滯留時間長，直至90 min放射性攝取值仍為(175.52±11.28)%ID/g；藥物無法通過血腦屏障，腦內攝取幾乎為本底；骨攝取值始終較低，可見18F-DCFPyL在體內穩定性較好，未發生脫氟；在肝、脾和肺組織均有一定的生理性攝取，尤其是脾臟，但均遠低于腎的放射性攝取值。可見該探針與68Ga-PSMA-11類似，主要經腎臟代謝，導致泌尿系統高攝取，而膀胱的高攝取將干擾前列腺組織微小病灶的探查。

a——18F-DCFPyL；b——19F-DCFPyL圖3 產品分析型HPLC圖譜a——18F-DCFPyL；b——19F-DCFPyLFig.3 Analytical HPLC profiles of 18F-DCFPyL and 19F-DCFPyL

圖4 18F-DCFPyL在正常NIH小鼠體內分布Fig.4 Biodistribution of 18F-DCFPyL in normal NIH mice

3.5 臨床PET顯像

注射示蹤劑60 min后顯像，圖5a可見雙側腮腺及頜下腺對稱性生理性攝取，甲狀腺形態可見，頸部及鎖骨上區未見明顯異常淋巴結濃聚。肝臟放射性分布大致正常，胰腺形態放射性分布均勻，兩側腎臟顯影且密度均勻，腹部可見條

索狀腸影，膀胱放射性濃聚，盆腔內多個淋巴結放射性攝取增高，最大者橫斷面約1.1 cm×0.8 cm，SUVmax為18.4，前列腺癌術后術區未見異常放射性攝取。圖5b1 CT可見盆腔內(近右側附股溝區)長徑約0.4 cm小淋巴結，伴放射性攝取值增高，SUVmax為3.6；圖5c2 PET圖像見骶骨局部放射性濃聚，SUVmax為5.2，但同機CT未見明顯骨質密度改變。

前列腺根治性切除術是早期前列腺癌最常用治療方法，但患者復發比例較大，對于早期生化復發患者，當PSA達到很高水平時，全身骨掃描、CT及MRI才可以發現局部復發或遠處轉移病灶，對PSA<10 μg/L生化復發患者的應用價值有限。18F-DCFPyL是一個特異性PSMA顯像劑，有明確的代謝過程和排泄途徑，在其他正常組織中，18F-DCFPyL的分布很少，因此有很好的T/NT(腫瘤組織/非腫瘤組織放射性攝取)值。在PSA還處于較低水平時，18F-DCFPyL PET顯像能夠早期探測全身是否存在轉移灶。Rowe等[7-8]對比了18F-DCFPyL PET顯像與傳統檢查方式CT和99mTc-MDP骨掃描，8例轉移性前列腺癌患者通過18F-DCFPyL顯像得到138處放射性攝取異常增高區域以及1處疑似增高區域，而CT與骨掃描僅得到30處確定病變區域以及15處疑似病變區域，該研究小組也證實18F-DCFPyL PET顯像能夠檢出Na18F和99mTc-MDP未檢出的前列腺癌骨轉移病灶。另一方面，在其他高表達PSMA的實體腫瘤中，小腸類癌、透明細胞腎細胞癌和高級別腦膠質瘤的18F-DCFPyL PET檢查已見文獻報道，同樣表現出良好的應用前景[12-14]。

圖5 生化復發患者注射18F-DCFPyL 60 min后PET/CT檢查結果Fig.5 PET/CT imaging of patient with biochemical recurrence of prostate cancer at 60 minutes after 18F-DCFPyL injection

4 小結

利用國產氟多功能模塊，可以實現自動化合成18F-DCFPyL。H3PO4、HCl和HI三種酸的水解效率相近，但高效、穩定的水解方法仍需進一步研究。18F-DCFPyL注射液的質量控制和小鼠安全性評價實驗證明該藥物安全可靠，符合臨床應用要求。18F-DCFPyL在正常小鼠體內經泌尿系統排泄，其余臟器放射性攝取值低。前列腺癌術后生化復發的患者18F-DCFPyL PET顯像能夠探查同機CT無法檢出的微小轉移灶。18F-DCFPyL能夠更好的早期診斷前列腺癌及探測前列腺癌生化復發患者的病灶。