18F標記多巴胺D2受體顯像劑在老齡及正常SD大鼠腦分布研究

王立振，徐宇平，潘棟輝，王辛宇，楊潤琳，嚴駿杰，盛 潔，黃錢煥，楊 敏

(1.江蘇省原子醫學研究所，衛生部核醫學重點實驗室，江蘇省分子核醫學重點實驗室，江蘇 無錫 214063;2.南京醫科大學，江蘇 南京 211166)

我國已進入“老齡化社會”，并且老年人口以每年800～1 000萬人的速度遞增,人口老齡化呼嘯而至，預計2020年將達到2.43億，2025年將突破3億，2033年突破4億,占總人口的1/3[1]。研究表明許多神經退行性疾病的發病率與人口老齡化密切相關，如阿爾茲海默氏病、帕金森病等，故其患病人數也將隨之不斷上升，這些疾病起病隱匿，目前只能根據臨床癥狀診斷[2]。現有的藥物、手術和綜合性治療可以一定程度的緩解癥狀，但無法逆轉或者停止病情的發展。因此，研究這些疾病的發病機理，做出早期診斷，早期人為干預，是延緩這類疾病的唯一有效方法，也是近年來神經科學研究領域關心的一個重要課題。

多巴胺作為中樞神經系統的重要神經遞質，主要參與運動、情感和神經內分泌的調節[3]。多巴胺系統是近30年來神經科學研究的焦點問題之一，一些疾病如帕金森病(PD)、精神分裂癥、Tourette 綜合征(TS)、注意缺陷多動障礙(ADHD)等均與多巴胺能神經遞質傳遞障礙有關[4]。在哺乳動物體內，多巴胺受體有5種亞型，分別為多巴胺受體D1至D5[5]。其中，多巴胺D2受體(DRD2)的變化與中樞神經系統疾病具有相關性，故對其研究和應用最多[6]。早在上世紀，就有諸多研究者[7-9]從分子和基因水平探索了年齡和多巴胺D2受體的關系，然而器官的功能或者疾病的產生和發展過程遠不止一個或幾個基因調控。疾病的進程受后天環境的影響遠比受先天基因的影響明顯，并且這種體外研究無法實時動態觀察體內過程，本文運用核醫學的手段，探索多巴胺D2受體與年齡的關系。與之前的研究手段相比，多巴胺D2受體的PET顯像能無創、動態、早期、定量地提供活體腦功能信息，為多巴胺D2受體的分布、數量和密度等變化提供靈敏、有效的手段，為相關神經系統疾病的臨床和基礎研究提供更直觀的方法[10]。目前廣泛應用的多巴胺D2受體顯像劑主要有11C-raclopride、18F-Fallypride、123I-IBZM、123I-epidepride等[11]。其中，18F-Fallypride與D2受體的特異性結合更高(Kd=3×10-11mol/L),且18F的半衰期適中，便于臨床應用與運輸[12]。

本研究制備了多巴胺D2受體顯像劑18F-Fallypride，純化后通過尾靜脈給藥，經micro PET顯像，考察18F-Fallypride在正常及老齡SD大鼠紋狀體表達的差異及各腦分區的分布，探索衰老與腦多巴胺D2受體的關聯性，為利用18F-Fallypride進行疾病和藥效研究的方法學提供依據。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

Sumitomo HM-7型回旋加速器：日本住友；Mini-Scan TLC薄層放射性掃描儀：美國Bio SCAN公司；18F-FDG專用合成模塊：北京派特；1525系列分析型高效液相色譜儀、2545系列半制備型高效液相色譜儀：美國Waters公司；CURIEMENTOR 3型活度計：德國PTW公司；AC 210S型電子天平：德國Sartorius公司；Agilent5TC-C18(2)色譜柱：美國Agilent公司；C18柱、CM柱、QMA柱：美國Waters公司；microPET:德國Simens公司；小動物麻醉機:SAR-830/P型，美國CWE公司。

1.2 主要材料與試劑

標記前體Fallypride：江蘇省原子醫學研究所分子影像中心提供；碳酸鉀乙腈、甲酸、甲醇：國藥集團化學試劑有限公司；氧18水：上海化工研究院；Kryptofix222(K2.2.2)：美國Sigma公司；18F-溶液：江原安迪科分子核醫學研究發展有限公司提供；異氟烷：上海雅培制藥有限公司。

1.3 實驗動物

4只正常SD大鼠：0.18～0.2 kg，購自常州卡文斯實驗動物有限公司；4只老齡SD大鼠：0.23～0.25 kg，由江蘇省原子醫學研究所實驗動物中心清潔級環境正常飼養22個月以上，實驗動物使用許可證號：SCXK(蘇)2014-0023。

2 實驗方法

2.1 18F-Fallypride制備及分析

根據文獻方法[4]按以下步驟制備顯像劑18F-Fallypride，加速器生產的18F離子傳出后吸附于QMA柱上，用K2.2.2/K2CO3洗脫于反應管，干燥；加入乙腈，干燥后加入4 mg Fallypride前體，在98 ℃油浴鍋中反應20 min；加入8×10-3L 水，通氣攪拌1 min。反應液經C18柱初步純化除去氟離子后用10 mL水洗C18柱，再用1 mL乙醇淋洗即得濃縮的18F-Fallypride，初產品再經半制備型HPLC進一步制備純化。HPLC分析檢測方法如下：色譜柱為Agilent5TC-C18(2)250 mm×4.6 mm分析柱，Waters2545泵，紫外檢測器(λ=254 nm)，流動相A為含0.1%甲酸的水溶液；流動相B為甲醇。梯度洗脫，從1 min的70%A和30%B減少到10 min的40%A和60%B，再從15 min的40%A和60%B增加到18 min的70%A和30%B，流速為1×10-3L/min，柱溫(30±0.5) ℃。

2.2 microPET顯像

2.2.118F-Fallypride顯像 正常SD大鼠和老齡SD大鼠各4只，尾靜脈注射18F-Fallypride 3.7 MBg/mL，15 min后進行microPET顯像，利用異氟烷-氧氣混合氣體(2.5%體積分數)麻醉，固定于microPET床板上。層厚0.78 mm，矩陣128×128，采集時間10 min，采集能窗350～650 keV。

2.2.2數據分析處理 microPET顯像圖采用OSEM 3D迭代法重建，ASIProVM軟件勾畫紋狀體為感興趣區，根據如下公式計算SD大鼠每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)。%ID/g=感興趣區域放射性物質攝取(μCi/g)/總注射劑量(μCi )×100。PMOD軟件融合圖像，定量分析腦分區攝取值，統計學分析用SPSS 19.0軟件。

2.3 病理實驗

顯像結束后，腹腔注射10%戊巴比妥鈉1 mL，開胸，心室穿刺灌注預冷的生理鹽水0.2 L，福爾馬林0.2 L，取全腦，冰凍切片，層厚20 μm，行蘇木素-伊紅(HE)染色，普通光學顯微鏡觀察兩組大鼠腦實質及紋狀體形態結構變化情況。

3 結果與討論

3.1 18F-Fallypride制備及質控

18F-Fallypride放射性峰保留時間為9.57 min，標記率>95%，放化純度>98%。PBS和血漿中放置2 h，HPLC檢測放化純度仍>95%，與文獻報道相似[12]。

3.2 microPET顯像

注射15 min后PET顯像顯示老齡SD大鼠雙側紋狀體，放射性物質濃聚高，輪廓清晰，形狀飽滿(圖1)，注射后15 min攝取值達(0.58±0.11)%ID/g,高于正常SD大鼠(0.39±0.14)%ID/g。PMOD軟件分析圖像(圖2)顯示18F-Fallypride廣泛分布于各腦區內，紋狀體SUV值最高(圖3)，海馬，皮層，丘腦等次之(數據列于表1，PMOD分析主要腦區變化示于圖4)。其中老齡鼠扣帶皮層、島葉、下丘腦、嗅球、中腦等攝取值分別為(0.154±0.013)%ID/g、(0.344±0.014)%ID/g、(0.244±0.019)%ID/g、(0.263±0.020)%ID/g、(0.216±0.012)%ID/g，高于正常大鼠(0.120±0.012)%ID/g、(0.182±0.002)%ID/g、(0.111±0.002)%ID/g、(0.127±0.007)%ID/g、(0.083±0.012)%ID/g。

3.3 病理實驗

HE染色結果示于圖5，顯示兩組SD鼠腦實質未見明顯受損，紋狀體染色清晰，正常組神經元胞漿豐富、核清晰可見，老齡SD大鼠可見部分神經元嗜酸性變或核破碎，偶伴有海綿狀變形、層狀或局灶性神經元壞死，其余無明顯形態學改變。

a——老齡大鼠；b——正常SD大鼠圖1 大鼠注射18F-Fallypride 15 min后 microPET 顯像圖a——Aged rats；b——Normal ratsFig.1 MicroPET imaging of rats 15 minutes after injection

a——老齡大鼠；b——正常SD大鼠圖2 大鼠PMOD軟件融合圖像a——Aged rats；b——Normal ratsFig.2 Fusion imaging of rats by PMOD

圖3 紋狀體雙側攝取變化Fig.3 Uptakes of bilateral striatum changes

圖4 PMOD分析主要腦區變化Fig.4 Main brain region changes analyzed by PMOD

4 小結

(1) 本研究制備了多巴胺D2受體顯像劑18F-Fallypride，標記率高，與文獻報道相似，穩定性好，為動物體內實驗研究打下基礎。

表1 PMOD分析老齡及正常SD大鼠各腦分區攝取值Table 1 Quantitative analysis of standard uptake values of each brain area in aged and

a——老齡大鼠；b——正常SD大鼠圖5 大鼠HE染色(×400)a——Aged rats；b——Normal ratsFig.5 HE staining of rats (×400)

(2) microPET顯像顯示，18F-Fallypride廣泛分布于腦內，其中紋狀體攝取最高，老齡SD大鼠腦分區攝取普遍高于正常SD大鼠組。

(3) 病理實驗顯示，兩組大鼠腦實質未見明顯受損，其中老齡SD大鼠可見部分神經元嗜酸性變或核破碎，偶伴有海綿狀變形、層狀或局灶性神經元壞死，可能由于這些病理改變，機體發生代償反應，導致多巴胺D2受體表達增高[13]，其余無明顯形態學改變。曾有文獻報道，早期輕型帕金森病會出現多巴胺D2受體上調[14]， 猜測這組老齡SD大鼠可能正處于PD早期階段，這一發現值得進一步探索。本研究通過核醫學顯像方式考察了正常及老齡SD大鼠腦多巴胺D2受體表達差異情況，并通過PMOD軟件勾畫詳細分析了正常及老齡SD大鼠腦各分區的數據，可為臨床早期診斷年齡相關性神經系統退行性疾病提供新的方法。同時隨著中國人口老齡化加劇，以及工業化、城鎮化、生態環境及生活方式變化等，阿爾茨海默病、抑郁癥的診治面臨更大的挑戰，需要進一步探索發病機理，實現早診斷、早治療。