國產氟多功能模塊自動化合成18F-6-氟-L-DOPA及其臨床初步應用

付華平，張曉軍，麻廣宇，劉 健，徐曉丹，徐白萱，張錦明

(中國人民解放軍總醫院 核醫學科，北京 100853)

對分化良好、糖代謝水平低的神經內分泌腫瘤(NETs)，18F-6-氟-L-DOPA(18F-DOPA)比18F-FDG具有更高的診斷價值[1]，歐洲將18F-DOPA寫入神經內分泌腫瘤診斷指南[2]。但由于親電合成需要氣體靶，且放化產率低和含載體，而親核合成工藝復雜[3]，18F-DOPA在臨床推廣應用有一定的難度。近年來，親核取代法合成18F-DOPA取得了較大的進展，除間接親核取代后采用手性催化劑合成18F-DOPA外，直接親核取代水解合成18F-DOPA方法簡單、重復性好，且不含載體、產品手性純度高，受到臨床的歡迎。文獻報道了多種直接親核取代合成18F-DOPA的方法，其中以碘鹽或硼酸酯為前體的合成方法，可以在常規的氟多功能模塊上實現大劑量、自動化的合成，使18F-DOPA在臨床的廣泛應用成為可能[4]。本研究在Tredwell等[5]的研究基礎上，以6-硼酯-二甲氧基-DOPA為前體，銅鹽Cu(OTf)2(py)4為催化劑，在國產氟多功能模塊上實現了簡單、快速合成18F-DOPA，經質控和倫理審批后，進行了初步的臨床評價。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

6-硼酯-二甲氧基-L-DOPA和銅鹽Cu(OTf)2-(py)4：德國ABX產品；19F-6-氟-L-DOPA標準品：加拿大TRC公司；Sep-Pak Light QMA柱、SEP-PAK C18柱：美國Waters公司；氧-18水(H18O豐度大于97%)、氨基聚醚(kryptofix，K2.2.2)：江蘇華益科技有限公司；碳酸鉀(K2CO3)：純度>99.997%，美國STREM公司；氫氧化鈉(NaOH)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸(CH3COOH)、抗壞血酸、丙酮：分析純，北京化學試劑公司產品； 無水乙腈(CH3CN)：純度>99.9%，美國Aldrich公司產品；57%氫碘酸(HI)：AR，百靈威化學試劑。

1.2 主要設備

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模塊：派特(北京)科技有限公司；高效HPLC分析儀：美國Waters公司，配515泵，2487紫外檢測器，Phenomenex Gemini 100 A C18 (4.6 mm×150 mm)分析柱，BioScan流動放射性檢測器；Discovery ST64 PET/CT掃描儀：美國GE公司；便攜式內毒素快速檢測儀：美國Charles River公司；電感耦合等離子體原子發射光譜儀(ICP-AES)：德國斯派克分析儀器公司；Bante321-Cu便攜式銅離子濃度計：上海般特。

1.3 動物實驗

正常雄性NIH小鼠5只，6～8周齡，(20±5) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2015．0001。

1.4 臨床患者

經本院倫理委員會同意(批準號：S2017-128-01)，正常受試者：男性一例，52歲；胰島細胞瘤復發患者：女性一例，22歲；簽署知情同意書。

2 實驗方法

2.1 18F-DOPA的自動化合成

使用PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模塊合成18F-DOPA，合成線路示于圖1。具體步驟：加速器經18O(p,n)18F反應得到18F-由N2載帶至QMA捕獲，用1.0 mL K2.2.2/K2CO3淋洗液(由5.50 g/L K2CO3水溶液0.2 mL和18.75 g/L K2.2.2乙腈溶液0.8 mL混合而成)將18F-從QMA柱洗入1號反應管，通入N2并加熱115 ℃除水至干，再將2 mL乙腈加入反應管繼續通氣加熱除水至干燥。10 mg 6-硼酯-二甲氧基-DOPA/10 mg Cu(OTf)2(py)4)溶于0.7 mLDMF溶液中，加入1號反應管，110 ℃密閉親核取代反應10 min后，加10 mL水稀釋反應液，并將中間體轉移至SEP-PAK C18柱，用5 mL丙酮分兩次把中間體洗脫至2號反應管，加熱除丙酮至殘余0.1 mL，加入0.5 mL 57%的HI，160 ℃加熱水解10 min，冷卻后加入4 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中和，混合液轉至中轉瓶，利用HPLC分離純化，分離柱為Grace Alltima C18(10 mm×250 mm)，流動相為0.1%乙酸水溶液(含1 g/L抗壞血酸)，流速為4 mL/min，產品放射性峰收集后直接通過除菌濾膜得到最終產品。

圖1 親核法合成18F-DOPA示意圖Fig.1 Nucleophilic synthesis of 18F-DOPA

2.2 18F-DOPA的質量控制

觀察產品顏色及澄清度；利用精密pH試紙測量酸堿度；利用分析型HPLC測量放化純度(分析柱為phenomenex luna C18 5 u(4.6 mm×150 mm)，紫外波長為254 nm，流動相為0.1%乙酸水溶液，流速為1 mL/min)，再與標準品共進樣鑒定產品；碘鉑酸薄層檢測產品中K2.2.2含量；氣相色譜分析產品有機溶劑殘留；便攜式內毒素檢測儀測量內毒素含量；電感耦合等離子體原子發射光譜儀測量產品中銅離子含量。

2.3 18F-DOPA體外穩定性

取三份18F-DOPA溶液并分別稀釋至370 GBq/L，第一份不添加任何試劑，即原液①，第二份中加入乙醇，配成乙醇體積分數為1%的溶液②，第三份中加入VC，配成VC10 mg/mL的溶液③。用分析型HPLC(2487紫外檢測器， BioScan流動放射性檢測器)分別測定①、②、③于1、3、5 h的放化純度，比較加入乙醇、VC和原液穩定性的不同。

2.4 藥物異常毒性實驗

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL 10 mCi/mL的18F-DOPA注射液，正常飼養，48 h觀察是否正常。

2.5 臨床PET/CT顯像

正常對照人僅用18F-DOPA顯像一次，而胰島細胞瘤復發患者采用18F-FDG和18F-DOPA分別顯像，中間間隔48 h。 顯像方法如下：顯像人員按體質量靜脈注射4.07 MBq/kg18F-DOPA，安靜環境下休息60 min后行全身PET/CT掃描，掃描范圍從頭部至股骨，PET圖像采用三維采集模式采集。利用CT數據對PET圖像進行衰減校正，PET圖像重建采用OSEM法，CT重建采用標準重建法。對于胰島細胞瘤復發患者，以ROI技術勾畫腫瘤區域并計算SUVmax。

3 結果與討論

3.1 18F-DOPA的自動化合成

圖2 HPLC分離產品的放射性色譜圖Fig.2 Radioactivity chromatograms of HPLC separation products

利用新型標記前體6-硼酯-二甲氧基-L-DOPA，在國產雙管氟多功能模塊自動化合成18F-DOPA，在制備HPLC上收集約7 min 時唯一放射性峰(圖2)，由于流動相中加入了抗壞血酸，干擾了紫外吸收，無法檢測紫外吸收峰。從氟-18離子到最終產品，合成耗時約為60 min，不校正合成效率為(10.0±2.3)%(n=6)，單次產量大于7.4 GBq，合成穩定性和可靠性高。連續成功合成14次。

間接親核合成18F-DOPA的效率較高，大于30%，除合成步驟多、準備時間長外，還需采用手性催化劑，合成后需要鑒別D-DOPA的含量[6]。而直接親核反應合成18F-DOPA步驟少，方法簡單，產品為無載體，且前體為手性化合物，親核和水解不會對產品的手性有影響，是目前研究的熱點。Lee等[7]使用鎳絡合物類標記前體在室溫下親核生成18F-6-氟-L-DOPA，制備時間短，條件溫和，但鎳絡合物前體合成較復雜，同時存在高價碘氧化劑；Hoepping[8]使用含有硝基的標記前體，通過親核取代、Baeyer-Villiger、酸水解三步反應一鍋法制得18F-DOPA，水解只需6 mol/L的鹽酸，條件溫和，放化產率較高；芳基碘翁鹽類標記前體可進行配體交換形成氟化碘鎓，熱分解后生成氟化物，Kuik等[9]利用二芳基碘鎓鹽為前體制備18F-DOPA，得到比活度高的產品，但合成時間需要2 h；Tredwell等[5]以芳基硼酸酯為前體，以Cu(OTf)2(py)4為催化劑親核取代制得18F-DOPA，該前體穩定易得，催化劑Cu(OTf)2(py)4已商品化，產品放化純度和光學純度都比較高，但需使用銅鹽作催化劑，應使用適當的方法除去銅鹽，保證產品中銅離子濃度在合格范圍。本研究采用雙BOC保護氨基的前體，在銅鹽催化下，18F取代硼酯，在國產多功能模塊上經親核、水解和HPLC純化，自動化得到可供注射的18F-DOPA。該方法的優點是合成前準備時間較短，操作簡單，合成效率較合適。

3.2 18F-DOPA的質量控制

產品為無色透明溶液，pH為6～7；放化純度大于99%，樣品放射性峰保留時間與標準品紫外吸收峰保留時間一致(圖3)；三批注射液樣品中K2.2.2含量低于50 μg/mL(碘鉑酸薄層未顯色)；乙腈、丙酮含量均低于0.04%w/w，內毒素低于5 Eu/mL；連續三批產品中銅離子含量分別為：1.05×10-6、0.50×10-6和1.07×10-6，低于藥典規定的注射劑中銅離子濃度25×10-6 [10]。本方法的質控關鍵點為銅離子含量，為了除去銅鹽，在產品親核取代后將半成品通過SEP-PAK C18柱純化，用大量水沖洗C18柱，最后用丙酮將酯溶性的產品從C18柱上淋洗到第二反應管再水解；最終產品經半制備HPLC純化。對比文獻合成該類二步法顯像劑時，由于采用一個反應管的多功能模塊，一般將半成品轉移到C18柱后，再從合適的淋洗液將產品淋洗回到原反應管；這種方法不但操作麻煩，而且不利于除銅離子。本研究的結果表明，雙反應管可有效除去銅鹽。為了方便實時測量，對比了Bante321-Cu便攜式銅離子濃度計與ICP-AES的結果，基本一致，便攜式銅離子濃度計適于產品的自檢。

圖3 分析型HPLC譜圖Fig.3 HPLC spectrum of 6-18F-L-DOPA

3.3 18F-DOPA體外穩定性

18F-DOPA原液放化純度為99.4%，室溫放置5 h后放化純度降為92.04%，臨床使用會造成骨顯像；加入VC或乙醇，5 h后放化純度為98.4%，提高了產品的穩定性(表1)。

18F-DOPA本身不穩定，在含鹽溶液中會自行氧化成活性醌類繼而聚合成多巴色素，導致其放化純度降低，加之放射性射線產生的自由基，可加速左旋多巴制劑的分解[11-12]。文獻發現在大劑量、 高濃度下18F-FDG也不穩定，加入適量的穩定劑乙醇可以提高其穩定性[13]。本研究參考乙醇的作用，在產品中加入微量穩定劑乙醇或還原劑VC，均可以提高18F-6-氟-L-DOPA的穩定性。在實際操作中，因注射液中乙醇含量的限制，以加入VC更合適。

3.4 異常毒性實驗

小鼠注射后48 h全部存活，未見異常毒性反應。

3.5 臨床初步應用

L-DOPA是神經遞質DP的原料，18F-L-DOPA濃集于紋狀體，根據放射性的分布18F-DOPA在上世紀八十年代用于診斷帕金森病，但由于是代謝型顯像劑，靈敏度不及受體類顯像劑，近年來逐步被受體類顯像劑如：123I-FP-CIT或18F-FP-CIT等取代。但由于其特有的靶向性，本研究首先在正常人上證實顯像劑臨床效果。結果表明，示蹤劑特異性濃集于紋狀體，證明了其靶向性。全身顯像表明，放射性可濃集于膽囊，胰腺有一定的攝取，主要從泌尿系統排泄(圖4)。

表1 18F-DOPA體外穩定性Table 1 Stability in vitro of 18F-DOPA

在胰島細胞瘤復發患者18F-DOPA顯像表明，MR所示占位區(C)，有放射性濃集(圖5E,F)；而18F-FDG顯像則為陰性(圖5A,B)，最后再次手術證實，該占位為胰島細胞瘤復發。

圖4 正常男志愿者注射示蹤劑60 min后顯像Fig.4 Set of images of a 52 years old normal male volunteers

4 小結

本研究采用國產氟多功能模塊，經改進雙管法合成工藝，可簡單、快速合成18F-DOPA，對推動國內18F -DOPA在臨床上的應用具有較大的意義。