胃癌干細胞制備方法及在胃癌侵襲轉移中的機制

鄒興斌

(長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031)

胃癌是臨床上常見的惡性腫瘤，目前，臨床上對于胃癌治療方法相對較多，包括手術療法、化療、放療等，分子靶向藥物作為一種新型的治療方法在胃癌治療中也開始運用〔1〕。這些方法雖然能改善患者癥狀，但是5年生存率相對較低，主要與胃癌的轉移、耐藥及復發等有關。腫瘤干細胞(CSCs)是一類特殊的細胞，具有自我更新能力、高效DNA修復能力及多向分化潛能〔2，3〕。研究發現，在多數惡性腫瘤中存在CSCs，該細胞具備自我分化能力，并且在結腸癌、肝癌、乳腺癌及胰腺癌中有表達〔4，5〕。目前，對于GCSCs的制備方法存在較大的爭議，常規分離鑒定方法以側群細胞(SP)法和細胞表面標志物分選法為主，這些方法雖然能分離鑒定GCSCs，但是效果不佳，獲得的細胞純度相對較低，難以滿足實驗需要〔6，7〕。本研究旨在探討胃癌干細胞的制備方法及其在胃癌侵襲轉移中的機制。

1 對象和方法

1.1材料 人胃癌SGC7901細胞株：長春醫學高等專科學校提供；GCSCs細胞：國家重點實驗室提供。8只裸鼠，體重20～30 g，平均(27±3)g，實驗過程中對裸鼠飼養、處理均符合《關于善待實驗動物的指導意見》〔8〕相關規則。所有試驗通過長春醫學高等專科學校動物委員會批準同意，喂養動物房間通風良好，晝夜12 h采光，恒溫、恒濕，定期紫外線消毒。

1.2主要儀器和試劑 見表1。

表1 主要儀器和試劑

1.3方法

1.3.1細胞分離及培養 ①細胞復蘇：從液氮灌中取凍存管，置37℃中水浴，快速搖晃確保1～2 min內融化，將細胞凍存液放置在10 cm板培養皿中，加入8 ml培養液，混勻，每天換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。②傳代培養：細胞貼壁融合80.0%以上開始傳代培養，取5 ml培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，加入胰蛋白酶漫過細胞，混勻后吸出消化液，37℃溫箱中保溫4 min，待細胞間隙變大，形態近似圓形后停止消化。③細胞凍存：選擇對數生長期細胞，利用負壓吸引器吸取培養皿上的培養基，用PBS沖洗3次，加入胰蛋白酶消化，吹打細胞。將獲得的懸浮生長細胞轉移到15 ml離心管中800 r/min離心3 min，去除上層清夜，加入凍存培養液，吹打吸管讓細胞均勻重懸。最后將1.0～1.5 ml細胞放入凍存管并置于-80℃冰箱中，次日放入液氮罐中保存。④胃癌細胞培養：取貼壁生長的人胃癌SGC7901細胞株，放入10.0%FBS的RPMI-1640培養基中，37℃、5%CO2，每2～3 d換液1次，待細胞培養融合90.0%時進行傳代培養。⑤胃癌干細胞培養：胃癌干細胞為懸浮生長細胞，將細胞放置在超低黏附培養瓶中，37℃ 5%CO2培養箱中培養，放入無血清培養基，接種后每天添加適量培養基，7～10 d開始傳代培養及擴增〔9，10〕。

1.3.2致瘤性和侵襲性 ①球形克隆實驗：取1×103個人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞，將其接種在超低黏附6孔板中，加入無血清培養基，37℃ 5%CO2培養箱中進行培養，接種后每天觀察瘤球形成情況。②平板克隆實驗，取1×103個人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞，將其接種在超低黏附6孔板中，用含有10.0%FBS的RPMI-1640培養基在37℃、5%CO2培養箱中培養，每2～3 d換液1次，每天觀察克隆形成情況。③裸鼠成瘤實驗：消化胃癌細胞吹打制備單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌，以PBS重懸細胞，采用血球計數板計數后PBS稀釋細胞到50 μl含所需細胞數，采用無菌注射器注射到裸鼠腋下，標準無菌條件下飼養，每3～5 d觀察動物狀態及成瘤情況〔11,12〕。

1.3.3轉移能力測定 Transwell遷移試驗測定人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞在胃癌轉移中的作用。讓血清饑餓12～24 h，制備人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞懸液，取24孔板，加入600 μl體積分數20.0%血清，將小室浸入孔中使其濕潤，充分消化細胞，待消化停止后開始計數細胞。按2×105細胞濃度取200 μl放細胞溶液到小室中，將24孔板放入37℃ 5%CO2培養箱中培養，根據兩種細胞遷移性能不同計算不同時間段透膜細胞數，將其放置在甲醛中固定15 min，放入1 ml結晶紫染色15 min，觀察透膜情況〔13〕。

1.3.4基因芯片法測定ANTXR2水平 將ANTXR2的編碼區載入真核表達載體pcDNA3.1(+)質粒中，取對數生長的人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞，消化后制備續保懸液，計數后按照每孔5×104個細胞接種在24孔板中，過夜培養后將稀釋好的干擾病毒和對照慢病毒分別放入細胞培養基中，培養24 h后換液一次，去除病毒，擴增后利用流式細胞儀分選感染細胞中的GFP陽性細胞，采用實時定量PCR方法檢測2種細胞下ANTXR2水平表達情況，利用免疫熒光法檢查ANTXR2及CD44共表達情況〔14〕。

2 結 果

2.1胃癌干細胞培養 人胃癌SGC7901細胞株培養后開始貼壁生長，培養條件為RPMI-1640(濃度為10.0%FBS)；GCSCs細胞為懸浮生長，培養條件為無血清培養基，細胞貼壁生長后呈梭形的間質形態。見圖1。

A為貼壁生長的人胃癌SGC7901細胞株；B為懸浮生長的GCSCs細胞；C為貼壁生長的GCSCs細胞(箭頭表示呈梭形的間質形態)圖1 不同培養條件下生長的胃癌細胞(×100)

2.22種細胞致瘤性和侵襲性比較 ①球形克隆實驗：將3×103個細胞接種在6孔板中，加入無血清培養基，連續培養20 d，隨機取5個視野，計數每個視野瘤球個數。結果顯示：GCSCs細胞瘤球數量為(63.92±4.51)個，顯著多于人胃癌SGC7901細胞株的(6.49±0.70)個(P<0.05)，見圖2。②平板克隆實驗：將1×103個細胞接種在6孔板中，加入由RPMI-1640組成的3 ml培養基中培養10 d，隨機取5個視野，計數每個視野瘤球個數。結果顯示：GCSCs細胞瘤球數量為(9.61±1.59)個，顯著多于人胃癌SGC7901細胞株的(1.78±0.82)個(P<0.05)。見圖3。③裸鼠成瘤實驗：成瘤能力是鑒定GCSCs細胞的金標準。結果顯示：裸鼠體內移植1×104個細胞球即可發生腫瘤。GCSCs細胞移植瘤直徑，顯著大于人胃癌SGC7901細胞株(P<0.05)。見圖4。

A為人胃癌SGC7901細胞株形克隆實驗結果；B為GCSCs細胞球形克隆實驗結果圖2 人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞球形克隆實驗(×100)

A為人胃癌SGC7901細胞株平板克隆實驗結果；B為GCSCs細胞平板克隆實驗結果圖3 人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞平板克隆實驗結果(×100)

A為GCSCs細胞成瘤情況(瘤體相對較大，瘤較多)；B為人胃癌SGC7901細胞株成瘤情況(瘤體單一，體積較小)圖4 人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞成瘤實驗結果

2.3人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞轉移能力測定 Transwell遷移試驗結果顯示，GCSCs細胞穿過基底膜細胞數為(171.92±12.31)個，顯著高于人胃癌SGC7901細胞株的(85.39±4.91)個(P<0.05)。結晶紫染色顯示，GCSCs穿過基底膜細胞數，多于人胃癌SGC7901細胞株，提示GCSCs轉移能力更強。見圖5。

2.4基因芯片法測定ANTXR2水平 采用流式細胞術檢測人胃癌SGC7901細胞株中ANTXR2陽性細胞比例占4.98%；GCSCs中ANTXR2陽性細胞比例占85.48%。通過對ANTXR2陽性的胃癌組織切片，實時定量PCR方法測定顯示：ANTXR2與干細胞標志CD44有共定位現象，提示ANTXR2是GCSCs細胞中的相關分子。見圖6。

A為人胃癌SGC7901細胞株轉移能力結果；B為GCSCs細胞轉移能力結果圖5 人胃癌SGC7901細胞株和GCSCs細胞轉移能力比較(×100)

圖6 基因芯片法測定ANTXR2水平結果

3 討 論

隨著人口老齡化日益加劇及生活方式的改變，導致胃癌病發生率呈現上升及年輕化趨勢。雖然人們對于胃癌的研究已獲得一些新的進展，但是對胃癌的發病機制尚不完全知曉。CSCs最早于1個世紀前被提出，經過后人的努力及研究使得CSCs得到進一步充實和補充〔15〕。2006年，美國對CSCs進行了定義〔16〕：CSCs是一種特殊的細胞，具備自我分化能力及多向分化潛能，在多種惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。由于胃腸道上皮代謝相對較快，導致上皮細胞突變率較低，但是干細胞壽命相對較長并且容易產生積累，從而易誘發癌變。目前，胃癌干細胞的制備及分離方法相對較多，與其他成體干細胞類似，胃癌干細胞主要通過細胞表面標志物進行分離和鑒定〔17〕。國外學者研究〔18〕顯示，在胃癌細胞中共存在三種腹膜轉移高潛力的細胞，且均可以分離獲得干細胞標志物。本研究中，通過成球培養法能成功分離/富集胃癌干細胞，同時，實驗結果還顯示，獲得的胃癌干細胞具有腫瘤干細胞特性，能富集胃癌干細胞，提示成球培養法是獲得胃癌干細胞的一種有效的方法〔19,20〕。

侵襲和轉移是胃癌的重要生物學特征，也是影響療效、術后復發和危及患者生命的獨立危險因素〔21,22〕。本研究表明，GCSCs細胞轉移能力更強。由于CSCs具備自我更新和高侵襲轉移特性，研究中以CSCs為模型，篩選出可能調控CSCs自我更新及侵襲的分子ANTXR2。ANTXR2又稱為毛細血管形態發生基因2，該基因位于染色體4q21.21上，能結合到炭疽毒素進入細胞中，屬于炭疽毒素兩個受體之一〔23〕。同時，ANTXR2具有與整合素相類似的性能，可以直接參與細胞外機制的調節。有報道顯示，ANTXR2基因突變容易引起小兒玻璃樣纖維瘤病。同時，ANTXR2能在正常及腫瘤血管內皮細胞中表達，并且在內皮細胞中表達能抑制細胞的增殖和小管形成能力〔24〕。本研究發現，人胃癌細胞ANTXR2表達后容易引起p-Src Tyr416磷酸化降低，從而引起p-Src Tyr527磷酸化位點增高。本研究結果提示胃癌干細胞在腫瘤侵襲、轉移中機制復雜，ANTXR2在胃癌干細胞侵襲轉移中發揮了重要作用，能進一步激活Src/ERK途徑調控胃癌干細胞的侵襲轉移，可以調控LRP6經過經典的Wnt信號通路發揮其生物學功能，從而促進腫瘤的發生、發展〔25,26〕。

綜上所述，采用成球培養法能成功分離/富集胃癌干細胞，具有多向分化、克隆及成瘤能力，同時ANTXR2在胃癌干細胞侵襲轉移中發揮了重要作用，可以作為胃癌預后指標。