缺血后處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠內質網應激相關蛋白葡萄糖調節蛋白78及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12的影響

劉鴻濤

(深圳市龍華區中心醫院 廣東醫科大學附屬龍華中心醫院心血管內科，廣東 深圳 518110)

急性心肌梗死是目前世界范圍內致病及致死的最主要原因之一。然而“缺血再灌注損傷”亦會對心肌造成損害。因此如何在心肌再灌注時對心臟進行較好地保護是當前的研究熱點，例如局部的缺血后處理，而通過再灌注開始時的多次短暫的缺血再灌注被證實具有一定的心肌保護作用〔1〕。臨床及動物實驗報道顯示可通過多種干預方式對心肌進行保護，但具體的有效機制尚不十分明確〔2〕。內質網在機體的鈣離子穩態、脂質生物合成及蛋白質折疊中發揮著重要作用，心肌發生缺血時常伴隨內質網的應激反應，內質網的應激反應是細胞生存的一種自身的保護反應，同時也可誘導細胞的凋亡〔3〕。蛋白激酶RNA樣內質網激酶(PERK)、肌醇必需酶(IRE)1和激活轉錄因子(ATF)6是內質網的觸發因子，內質網被觸發后將釋放出葡萄糖調節蛋白(GRP)78，而GRP78被認為是內質網應激的主要標志物之一〔4〕。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-12是半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，目前研究顯示內質網應激能夠將其激活，然后進入細胞液激活其他的caspase家族成員，最終完成細胞的凋亡〔5,6〕。本研究建立大鼠心肌缺血再灌注損傷動物模型，分析其在缺血后處理對內質網應激損傷相關蛋白GRP78及caspase-12表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物分組 選取雄性Wistar大鼠30只，購自廣東省實驗動物監測所，體重250～300 g，平均(276.3±15.4)g,將大鼠編號為1～30號，通過隨機數字表將其均分為A組(空白對照組)、B組(心肌缺血再灌注損傷組)、C組(心肌缺血后處理組)，每組10只。本研究操作及相關內容均經醫院倫理委員會批準。

1.2手術操作 所有動物經腹腔注射戊巴比妥(60 mg/kg)麻醉，隨后使用16號管予以插管，同時采用小型動物呼吸機(SAR-830 A/P,CWE)給予輔助通氣；操作過程中實時監測大鼠的體溫，使大鼠體溫保持在36～38℃，通過中部胸骨打開胸廓，去除心包后暴露心臟，將單根7號縫線置于左冠狀動脈的近端，A組大鼠操作至此結束，曠置3 h。B、C組大鼠則進行結扎45 min，覆蓋一小塊紗布防止動脈損傷，通過觀察心肌的顏色改變和局部的運動障礙對心肌的缺血進行確認。誘導性缺血結束后取出結扎，使B組大鼠心肌組織再灌注2 h；C組大鼠則給予3個循環的10 s缺血及10 s再灌注的缺血后處理操作，之后再灌注2 h。

1.3指標分析

1.3.1心肌梗死面積的檢測 在2 h再灌注結束后，對所有大鼠進行安樂死處理后取出心臟，使用1%的Evans藍進行逆行灌注顯示出危險區域(AAR)，然后將心臟自頂端進行組織切片，并在室溫下1%磷酸鹽緩沖的2,3,5-三苯基四唑氯化物溶液(TTC)中孵育，以顯示出梗死的心肌組織，后將切片置于10%甲醛中進行固定，使用Image J軟件定量分析梗死面積。缺血面積百分比=AAR/總心室面積×100%，梗死面積百分比=梗死區域面積/缺血區域面積×100%。

1.3.2內質網應激相關蛋白的免疫印跡分析 對AAR區域的心肌組織進行Western印跡分析，A組則取類似部位心肌組織進行檢測，將-80℃液氮內冷凍的心肌組織粉碎后提取蛋白質，根據產品的使用說明書通過Bio-Rad DC蛋白測定試劑盒(Calif)檢測蛋白濃度，后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離并轉移至硝酸纖維素膜上，將膜在4℃與一抗孵育過夜，一抗為抗GRP78山羊抗體(1∶1 000，Santa Cruz)，抗caspase-12小鼠抗體(1∶500，IMGENEX)，GAPDH(小鼠抗體;Sigma-Aldrich)用作對照，二抗為抗山羊辣根過氧化物酶(1∶5 000)及抗鼠免疫球蛋白(1∶5 000)，使用Lumino-image分析儀(Fujifilm)顯示條帶的吸光度值。

1.3.3各組大鼠的神經行為學分析 依據現有的文獻在處死大鼠之前對其神經行為學進行評估〔7,8〕，內容包括：(1)整體的神經損害評分：0分為無神經損害，1分為對側前肢屈曲及肩關節內收，2分為對外側推力的抵抗降低，3分為同側的旋轉運動；(2)旋轉實驗：使用20 r/min木條，記錄大鼠5 min內從開始轉圈至掉落的時間；(3)懸吊實驗：45 cm高的鐵絲，記錄大鼠從開始懸吊至掉落時的時間；(4)平衡木行走實驗：平衡木長度60 cm，寬度5.1 cm，高度50 cm，記錄大鼠通過的時間。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1三組大鼠心肌梗死面積比較 A組心肌切片經Evans藍與TTC染色處理后均呈現藍色，表明無缺血及梗死區域，B組與C組心肌組織切片可見紅色的缺血區域及白色的梗死病灶區域，宏觀上看B組缺血及梗死病灶面積大于C組。經Image J軟件量化分析后顯示，與組織切片相一致的結果，即C組心肌組織的缺血面積百分比〔(41.22±8.86)%〕及梗死面積百分比〔(30.19±7.74%〕均顯著低于B組〔(56.25±10.24)%、(39.67±8.54)%;t=3.510、2.601，P=0.003、0.018〕。見圖1。

圖1 三組大鼠心肌切片染色結果

2.2三組大鼠心肌組織的Western印跡分析 A組大鼠的相應部位心肌組織的GRP78及caspase-12蛋白表達均低于B組及C組(P<0.05)；C組大鼠的caspase-12蛋白表達低于B組，而GRP78蛋白表達高于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 三組大鼠心肌組織中GRP78及caspase-12蛋白表達比較

與A組比較：1)P<0.05;與B組比較：2)P<0.05

圖2 三組大鼠Western印跡分析條帶

2.3三組大鼠神經行為學比較 三組大鼠的神經損害程度、旋轉實驗、懸吊實驗以及完成平衡木行走實驗的各項數值之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組大鼠神經行為學評估比較

3 討 論

心肌缺血后的再灌注是緩解患者臨床癥狀及預防缺血進一步惡化的最有效手段，但同時伴隨著再灌注損傷，表現為心肌細胞的凋亡及梗死病灶的擴大化〔9〕。心肌缺血后處理的積極作用最初由2003年一項國外的研究通過狗心肌缺血再灌注損傷發現，后于臨床實踐中選擇ST段抬高的急性心肌梗死患者為研究對象，經急診冠狀動脈血管成形術后給予缺血后處理能夠顯著降低心肌的梗死病灶區域面積。本研究中通過大鼠的急性心肌缺血模型亦得到類似的結果，缺血后處理操作相對于單純的缺血再灌注能夠著減少心肌的缺血及梗死面積。

內質網的應激反應由于涉及機體的多種生理及病理過程從而發揮著重要的影響。有研究報道稱，內質網的應激反應在多種細胞和組織內同時具有利弊作用，主要取決于細胞生存與凋亡間的平衡〔10〕。一項研究顯示，GRP78在腫瘤、腦組織及心肌缺血再灌注內發揮著重要的細胞保護作用〔11〕；體外研究中缺血再灌注之前使用藥物激活GRP78能夠顯著減少心肌細胞的凋亡，缺血前通過二氧化硫的預處理亦能夠減小大鼠缺血心肌的梗死面積，目前認為這些缺血預處理引起的心臟保護作用與GRP78的表達增加相關，轉染GRP78的反義寡核苷酸能夠逆轉這種保護作用。這與本研究的結果相一致，缺血后處理大鼠的GRP78蛋白表達量顯著高于單純再灌注損傷的大鼠模型，組織病理學同樣證實缺血后處理對減少心肌細胞凋亡相關的心肌保護作用。但有部分研究報道缺血再灌注2 h后缺血后處理能夠降低內質網的應激反應，主要表現為鈣網織蛋白的降低〔12〕，因此有必要綜合多種內質網應激的相關標志物及多個采集時間點以進一步加以證實。

人體內細胞的凋亡和炎癥反應等與caspase家族具有密切關聯，有研究證實，caspase-12能夠在內質網應激反應時激活，然后進一步調節細胞凋亡通路從而誘導細胞凋亡〔13〕。多種外界的物理、化學、放射、缺氧等刺激均可引起細胞內發生內質網的應激，最終的凋亡均與caspase-12相關〔14〕。本研究結果顯示單純的心肌缺血再灌注能夠使心肌細胞內caspase-12表達增加，宏觀上顯示心肌的缺血及梗死病灶增加，而缺血后的處理操作能夠使其表達降低，從而減少心肌細胞的凋亡，缺血及梗死面積減少。

另外，本研究存在一定的局限性，首先表現在納入研究的動物數量較少，同時未納入所有的內質網應激相關的主要標記物及凋亡相關的其他通路蛋白，未對再灌注后的檢測時間點進行細化分析，因此獲得的結論力度欠佳，但本研究的結果初步證實對于大鼠的心肌缺血再灌注損傷模型，缺血后的處理能夠一定程度上減少心肌缺血及梗死的面積。其作用與內質網的應激反應增加相關，表現為GRP78標志物的表達增加，并且這種應激能夠通過抑制凋亡通路降低心肌細胞的凋亡，從而對缺血心肌產生保護作用，改善患者心功能和生存預后。神經行為學評估結果顯示心肌的缺血再灌注損害并未對大鼠的神經行為學產生顯著影響，可能與缺血再灌注的時間較短相關。