吡咯烷二硫代氨基甲酸酯治療急性胰腺炎大鼠的效果及其作用機制

王艷娥

(武漢市中心醫院，湖北 武漢 430000)

重癥急性胰腺炎(SAP)病理過程開始于胰腺腺泡細胞的破壞，細胞因子學說認為胰腺腺泡細胞被破壞后，病變處細胞因子大量釋放，進入體循環，進而誘發全身炎癥反應綜合征〔1〕。研究〔2〕發現左旋精氨酸誘導的急性胰腺炎(AP)發病機制與核因子(NF)-κB活化、氧化應激有關。 NF-κB活化發生核移位與相應靶 DNA結合誘導，從而加重胰腺炎的臨床癥狀。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)是一種重要的抗氧化劑，可通過抑制NF-κB通路抑制κB蛋白降解，進而達到阻止NF-κB活化核移位過程〔3〕。研究〔4〕發現重要的晚期炎癥因子參與了膿毒癥的病理過程，并且有望成為治療SAP的新靶點； 高遷移率蛋白(HMG)B1是一類被證實與SAP具有重要關系的非組核蛋白，但相關機制還不明晰。本研究探討PDTC治療AP大鼠的效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取SPF級SD大鼠72只，雌雄不限，平均(210±6.4)g，喂養于23～25℃、光照12 h、相對濕度45%～60%的環境中，自由進食進水。

1.2實驗藥品、儀器 PDTC、5%牛黃膽酸鈉購于Sigma公司；NF-κB、HMGB1一抗、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均購于南京建成生物研究所；Western裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、電化學發光(ECL)液、酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購于南京凱基藥物有限公司；酶標儀購于美國BD公司。

1.3實驗分組與造模 SPF級SD大鼠72只隨機分為假手術組、模型組、PDTC組各24只，術前12 h禁食，腹腔注射2%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉；以上腹正中為切口，5號皮試針于十二指腸乳頭附近腸壁上戳一小孔，改用另5號皮試針置入腸腔，經乳頭探入膽胰管內，用顯微血管夾分別夾閉肝門部膽管和膽胰管穿刺針處；勻速0.05 ml/min注射5%牛黃膽酸鈉1 ml/kg，見胰腺組織充血水腫、點片狀出血后，撤血管夾，縫合腸壁穿刺孔，關腹。術后皮下注射生理鹽水20 ml/kg復蘇、分籠安置。假手術組只行經乳頭膽胰管穿刺而不注射任何藥物〔5〕。

1.4干預方法 PDTC組于建模前腹腔注射30 mg/kg的PDTC，假手術組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.5胰腺組織HE染色 取各組胰腺組織，10%甲醛固定過夜，脫水后石蠟包埋并切片，脫蠟后梯度酒精脫水、蘇木素-伊紅染色，晾干、樹膠封片，顯微鏡下觀察組織結構情況〔6〕。

1.6ELISA法 大鼠心臟取血3 ml，離心后分離血清，酶標儀ELISA法檢測丙二醛(MDA)、白細胞介素(IL)-1、淀粉酶(AMY)水平，實驗操作嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.7Western印跡法 蛋白裂解液提取胰腺組織核蛋白以檢測NF-κB活性；蛋白裂解液提取胰腺總蛋白以檢測HMGB1水平；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉至PAGE膜并用5%脫脂牛奶室溫2 h封閉，分別加入一抗后4℃過夜，次日Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗5次后滴加羊抗兔二抗1 h室溫孵育后ECL化學顯影〔7〕。

1.8統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析，t檢驗。

2 結 果

2.1各組胰腺組織病理學觀察 假手術組可見胰腺組織結構清楚、未發現結構破壞、炎癥細胞浸潤等；模型組胰腺組織水腫明顯，小葉間隙增大，胰腺組織中存在大量的紅色滲出物，腺泡腫脹，鏡下檢查可見壞死病灶，壞死病灶區域內腺泡結構紊亂，細胞核發生凝固、壞死、溶解、細胞膜破裂；PDTC組胰腺組織的病變程度較模型組病變更輕，但是較假手術組顯著加重。見圖1。

2.2各組血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平比較 造模后24、48及72 h，模型組、PDTC組血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平均顯著高于假手術組(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC組血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平均顯著低于模型組(P<0.05)；見表1。

圖1 各組胰腺組織HE染色情況(HE，×400)

指標組別24 h48 h72 hHMGB1(μg/ml)假手術組1.21±0.201.26±0.191.23±0.23模型組2.67±0.771)3.81±0.931)3.92±0.871)PDTC組1.63±0.341)2)1.78±0.501)2)1.94±0.481)2)MDA(nmol/ml)假手術組11.42±2.0111.85±1.9311.62±2.20模型組32.72±5.591)36.81±6.201)39.94±5.131)PDTC組22.18±4.201)2)25.94±5.771)2)20.76±5.381)2)IL-1(ng/ml)假手術組258.2±38.6262.7±41.9256.1±43.0模型組596.8±94.21)941.6±148.61)990.8±159.31)PDTC組392.1±77.61)2)438.2±89.51)2)411.3±73.41)2)AMY(U/L)假手術組114.3±18.4116.0±21.5117.2±19.5模型組339.2±59.11)287.6±52.81)238.6±42.51)PDTC組244.6±41.41)2)195.0±38.71)2)169.2±33.51)2)

1)與假手術組比較，2)與模型組比較：均P<0.05；下表同

2.3各組胰腺組織中NF-κB蛋白相對表達強度比較 造模后24、48及72 h，模型組和PDTC組胰腺組織中NF-κB蛋白相對表達強度均顯著高于假手術組(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC組胰腺組織中NF-κB蛋白相對表達強度均顯著低于模型組(P<0.05)；見表2。

表2 各組造模后不同時間胰腺組織中NF-κB蛋白相對表達強度比較

2.4各組胰腺組織中HMGB1蛋白相對表達強度比較 造模后24、48及72 h，模型組、PDTC組胰腺組織中HMGB1蛋白相對表達強度均顯著高于假手術組(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC組胰腺組織中HMGB1蛋白相對表達強度均顯著低于模型組(P<0.05)；見表3。

表3 各組造模后不同時間胰腺組織中HMGB1蛋白相對表達強度比較

3 討 論

AP約20%可發展為SAP，而SAP并發癥較多、病情兇險并具有較高的病死率，相關統計〔8〕顯示目前SAP的總體病死率可達21%～35%。現階段SAP伴多器官功能損傷的機制尚不明晰，研究〔9〕發現HMGB1在SAP大鼠中呈現高表達，并認為SAP的發生、發展可能存在HMGB1的參與。HMGB1由巨噬細胞分泌，是一類廣泛存在于真核細胞內的非組核蛋白，其可作為晚期炎癥介質參與膿毒癥的病理過程，并預測HMGB1有望成為治療SAP的新靶點。經過資料〔10，11〕總結認為HMGB1參與炎癥反應主要有以下5種機制：①HMGB1能刺激單核/巨噬細胞、中性粒細胞表達釋放多種炎癥因子；②HMGB1的自身毒性作用；③HMGB1與其他炎癥因子的相互促進作用；④HMGB1能增加上皮細胞的通透性；⑤HMGB1能促進內皮細胞的炎性反應，并破壞其屏障功能。

NF-κB是一類能與多種基因啟動子部位的κB位點發生特異性結合的結合蛋白總稱，亦是一類促進轉錄的DNA。 研究〔12〕發現TNF-α、IL-1等與SAP病程密切相關的炎癥因子的基因啟動部位均含有NF-κB位點，故而NF-κB對TNF-α的基因蛋白表達具有調控作用。但目前HMGB1基因啟動子上是否存在κB的結合位點還不確定。故而，還無法肯定κB是否能調控HMGB1的表達。

本研究結果提示PDTC治療AP大鼠能顯著減輕炎癥反應程度。這可能是因為PDTC抑制AP大鼠胰腺NF-κB的活化，進而降低了AP大鼠炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥反應和組織損傷。

本研究結果提示PDTC治療AP大鼠能夠降低胰腺組織中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白表達。PDTC是一種含SH的強抗氧化劑，其容易進入細胞并在細胞內去乙酰化后生成半胱氨酸達到抗氧化作用〔13，14〕。PDTC抑制NF-κB活化的機制主要通過降低脂質過氧化物酶的活化，減少NF-κB抑制蛋白降解，從而抑制NF-κB活化；通過與巰基結合，降低NF-κB的DNA結合活性，從而降低胰腺組織中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白表達，從而減輕炎癥反應程度，起到保護胰腺的作用〔15〕。