ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變分析

梁繼珍 蘇寧 謝亞琳 易基群

廣州市紅十字會醫(yī)院腫瘤科（廣州 510220）；2廣州市胸科醫(yī)院腫瘤科（廣州510095）

肺癌是目前發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，75%的患者在診斷時就已經(jīng)是局部晚期或遠處轉移［1］，其中腺癌是肺癌中最常見的亞型。在接受全身化療的晚期非小細胞肺癌患者中，有80%的患者僅僅通過小活檢標本或細胞學樣本明確診斷［2］。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等驅(qū)動基因檢測是肺癌分子診斷的重要組成部分，而其檢測方法眾多，目前在臨床應用最廣泛的檢測方法包括ARMS（amplification refractory mutation system）法和Sanger測序法［3-4］。理論上前者靈敏度及特異度均較高，但二者在臨床小樣本檢測中的差異未見相關報道。結合目前臨床晚期肺癌的病理標本絕大多數(shù)為小組織樣本的現(xiàn)狀，有必要對二者檢測晚期肺腺癌小樣本EGFR基因突變的價值進行比較。

本研究擬通過ARMS法和Sanger測序法對近3年晚期肺腺癌小標本組織進行EGFR基因突變檢測，回顧性分析2種檢測方法EGFR基因的各自分布，及其與臨床病理特征的關系，并對其二者的檢測結果一致性進行初步比較。

1 對象與方法

1.1 研究對象 篩選并回顧性收集廣州市紅十字會醫(yī)院和廣州市胸科醫(yī)院2013年1月至2016年12月初診晚期肺腺癌病歷資料。收集的臨床病理資料包括年齡、性別、吸煙史、活檢部位、活檢方法、標本性質(zhì)、原發(fā)腫瘤分期、淋巴結分期、遠處轉移分期、TNM分期。共收集到ARMS法檢測標本102例、Sanger測序法檢測標本138例，其中39例標本進行了上述2種方法的檢測。臨床分期根據(jù)IASLC 2009年制定的NSCLC分期標準進行評定。吸煙史在患者初診時采集，分為：（1）非吸煙（吸煙≤ 100支）；（2）吸煙（吸煙＞100支）。所有患者已經(jīng)被告知并同意使用其標本用于基因檢測。試驗已獲得醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 標本采集 本研究納入的小標本通過以下方式獲取：（1）支氣管鏡活檢；（2）經(jīng)皮肺穿刺活檢；（3）經(jīng)皮胸膜穿刺活檢；（4）淺表淋巴結/皮下結節(jié)部分切取或完整切除標本。組織活檢后經(jīng)10%福爾馬林固定并石蠟包埋后，切取4 μm載玻片用于病理分析及基因檢測。

1.3 EGFR基因檢測 EGFR基因分別使用ARMS法和測序法進行檢測。大致過程如下：（1）病理評估：2位病理科醫(yī)生分別核對石蠟組織的HE染色玻片，確保腫瘤組織比例＞50%，切取每片4 μm厚的切片10張用于后續(xù)檢測；（2）DNA提取：使用DNeasy Blood and Tissue Kit（No.69504；Qiagen，Valencia，CA）提取腫瘤組織DNA；（3）EGFR檢測：ARMS法使用AmoyDx人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒（No.ADx?EG01；廈門艾德）在Lightcycler 480（羅氏公司）儀器進行；測序法使用4組引物對EGFR外顯子18-21進行PCR擴增，使用Big Dye Terminator Version 3.1循環(huán)測序試劑盒（Applied Biosystems）和 ABI3700 genetic analyzer（Applied Biosystems）進行正向和反向測序。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行。計數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）描述，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，計量資料采用描述，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ARMS法檢測EGFR結果及其與臨床病理特征的關系 ARMS法檢測102例樣本，EGFR突變占47例（46.1%）、野生型55例（53.9%），其中外顯子19 del突變26例（25.5%）、外顯子21 L858R突變17例（16.7%）、外顯子19 del、21 L858R雙突變及外顯子19 del、21 L861Q雙突變各1例（1.0%）、其他突變2例（2.0%）（圖1）。EGFR基因突變與各臨床病理特征之間的關系如表1所示。統(tǒng)計分析提示女性EGFR基因突變率高于男性（61.9%vs.35.0%，P=0.007），而非吸煙與吸煙EGFR基因突變未見顯著差異（52.5%vs.36.6%，P=0.115）。EGFR基因突變與年齡、活檢部位、活檢方法、標本性質(zhì)、原發(fā)腫瘤、淋巴結、遠處轉移、分期無關（P＞0.05）。

圖1 晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變（ARMS法，102例）Fig.1 EGFR mutation by ARMS method in small specimen of advanced lung adenocarcinoma（n=102）

2.2 Sanger測序法檢測EGFR結果及其與臨床病理特征的關系 138例樣本進行測序法EGFR基因突變檢測結果如圖2。EGFR突變52例（37.7%），其中外顯子19 del突變22例（15.9%）、外顯子21 L858R突變19例（13.8%）、其他突變11例（8.0%）。不同活檢部位間的EGFR基因突變存在一定的差異（P=0.049），而EGFR基因突變與年齡、性別、吸煙狀態(tài)、活檢方法、標本性質(zhì)、原發(fā)腫瘤、淋巴結、遠處轉移、分期均無關（P＞0.05）（表2）。女性與男性、非吸煙與吸煙EGFR基因率突變分別為46.4%vs.31.7%（P=0.080）、40.3%vs.34.8%（P=0.511）。

2.3 ARMS法和Sanger測序法比較EGFR基因的一致性 39例標本進行了ARMS法和測序法2種方法檢測，EGFR基因突變的一致率為64.1%（25/39）（表3）。一致性分析提示兩種EGFR基因檢測方法的結果具有中等的一致性，Kappa系數(shù)等于0.499（P＜ 0.001）。

3 討論

NCCN指南推薦根據(jù)是否存在EGFR等驅(qū)動基因事件指導晚期肺腺癌的一線治療，且不同EGFR突變類型間靶向藥物治療的療效也存在差異［5］，故準確檢測肺腺癌患者EGFR基因突變，有助于晚期肺癌患者的個體化治療。EGFR基因突變與眾多因素有關，包括臨床因素、檢測方法、標本因素和異質(zhì)性等［6］。

表1 ARMS法晚期肺腺癌EGFR基因突變與臨床病理特征的關系Tab.1 The relationship between EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by ARMS method and clinical pathologic features 例（%）

圖2 晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變（測序法，138例）Fig.2 EGFR mutation by sequencing method in small specimen of advanced lung adenocarcinoma（n=138）

Sanger測序法和ARMS法是EGFR基因檢測最經(jīng)典和最廣泛應用的方法。前者能檢測到10%～20%及以上的EGFR突變細胞，而ARMS法可檢測出組織中0.1%～1%的突變體［3-4］。當樣本中DNA難以達到分光光度法所能檢測的最低限度時，小劑量低比例的腫瘤衍生DNA常被測序法誤判為EGFR野生型［7］。有研究認為測序法可能漏掉25%的突變陽性病例［8］。而有研究證實EGFR基因突變還存在量上的差異即高豐度和低豐度，二者使用靶向治療的療效也不存在差異［9］。

檢測樣本的選擇也是影響檢測的重要因素。理想的檢測樣本是新鮮腫瘤組織或冰凍腫瘤組織。而臨床診斷的腫瘤組織標本通常經(jīng)由福爾馬林固定并包埋于石蠟中，此過程會破壞核酸的完整性，尤其是福爾馬林固定超過24 h或者蠟塊保存超過3年的組織［10］。另外，微創(chuàng)技術的應用和醫(yī)學倫理的要求使得晚期肺癌的活檢樣本也越來越小。目前基因檢測所需的最少惡性腫瘤細胞數(shù)目尚無定論，推薦選擇至少含有200～400個腫瘤細胞的較大樣本進行基因檢測［11］。隨著技術手段的進步，目前用于EGFR基因檢測的樣本日益多樣化，包括手術切除標本、小活檢樣本、胸水樣本、外周血樣本等；有研究顯示使用ARMS法對惡性胸腔積液中EGFR基因檢測，其突變率為54.5%，低于組織樣本檢測［12］。

本研究分別使用ARMS法和測序法檢測102例和139例肺腺癌小標本EGFR基因突變，二者的EGFR突變率分別為46.1%和37.7%。臨床特征分析提示女性ARMS法EGFR基因突變陽性率顯著高于男性；在ARMS法不同吸煙狀況，測序法不同性別，測序法不同吸煙狀況之間EGFR突變雖未達到統(tǒng)計學差異，但仍能看出在肺腺癌小標本EGFR突變在不同性別及吸煙狀況間存在差異的趨勢。對比國內(nèi)研究，使用ARMS法檢測119例肺腺癌標本，突變率為49.58%，在女性及不吸煙患者中突變率較高［13］。本研究的結果與其相似。標本類型方面，本研究選擇了4種不同類型的小標本進行檢測，分析不同標本類型、活檢方式的EGFR突變的差異。筆者注意到測序法不同活檢部位之間的EGFR突變陽性率達到了統(tǒng)計學差異（P=0.049），但此結果可能為樣本選擇誤差所致。通過39例完成測序法和ARMS法EGFR基因突變檢測樣本的比較，二者EGFR基因突變具有中等的一致性。需注意到3例胸膜活檢的樣本中存在2例（66.7%）的不一致，提示對于一些腫瘤細胞較少的樣本使用較敏感方法檢測的必要性。本研究由于是在兩個不同的實驗室使用不同的標本、不同的檢測方法進行的，產(chǎn)生上述差異的原因，還需考慮到腫瘤組織內(nèi)的異質(zhì)性［14］。

表2 Sanger測序法晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變與臨床病理特征的關系Tab.2 The relationship between EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by sequencing method and clinical pathologic features 例（%）

表3 ARMS法與測序法晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變的一致性Tab.3 The consistency of EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by ARMS method and sequencing method 例（%）

本研究進一步提示臨床上采用ARMS法進行小組織樣本進行EGFR基因檢測，可能進一步提高EGFR突變檢測的檢出率，但EGFR突變敏感性和精確度的提高是否有助于臨床獲益有待進一步分析。總體而言，肺腺癌小標本組織通過ARMS法和測序法進行EGFR基因突變檢測具有一定的差異，參照測序法小組織樣本EGFR基因結果需謹慎進行臨床決策。