丹參素對腹膜粘連組織成纖維細胞膠原合成與降解的調控

曾煦欣 陳應軍 毛建文 王芳 李艷萍 蔣泓 張麗華

1佛山科學技術學院口腔醫學院（廣東佛山 528000）；2佛山市第一人民醫院（廣東佛山 528000）；3廣東藥科大學（廣州 510006）

手術后腹膜粘連（術后粘連）是腹盆腔手術常見并發癥，發生率達90%以上，常導致腸梗阻、慢性腹痛、婦女不孕等后遺癥發生［1-2］。術后粘連主要成因是組織受損處沉積的纖維蛋白未能及時被體內清除，成纖維細胞長入后過量分泌膠原等細胞外基質，導致纖維蛋白最終機化形成臟器間、臟器與腹膜間的永久性粘連。中藥丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）具有祛瘀止痛、活血通經的功效，近年被廣泛用于術后粘連防治，效果良好［3］。本課題組前期對丹參防治術后粘連的藥效基礎與作用機制進行初步研究，從人體與大鼠腹膜粘連組織中分離培養出成纖維細胞（adhesion tissue fibro?blasts，ATF），發現丹參可抑制ATF增殖與膠原合成［4］，其水溶性成分丹參素（Danshensu，DSS）通過下調轉化生長因子β1（TGF?β1）mRNA水平抑制ATF增殖［5］。本研究使用TGF?β1刺激ATF模擬術后粘連的病理微環境，通過檢測與膠原合成與降解相關的Ⅰ型膠原蛋白（COL?Ⅰ）、基質金屬蛋白?1（MMP?1）與基質金屬蛋白酶抑制劑?1（TIMP?1）表達水平，考察DSS對ATF細胞外基質的影響，以進一步探討其分子藥理學機制，為傳統中藥丹參在術后粘連防治領域中的應用提供更多理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 丹參素鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院），DMEM高糖培養基（吉諾生物醫藥技術有限公司），胎牛血清（Hyclone公司），0.25%胰酶（GIBCO公司），磷酸鹽緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司），Human TGF?β1（Invitrogen公司），CKK?8試劑盒（日本東仁化學），RNAprep試劑盒（TIANGEN公司），RT試劑盒（TAKARA公司），SYBR?Premix Ex TaqTM（TAKARA公司），Human COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1 ELISA 試劑盒（CUSABIO BIOTECH公司）。

1.2 儀器 細胞培養板、培養皿與培養瓶（Cornig?Costar公司），HHB11500型電熱恒溫箱（廣州醫療設備廠），DS?Ⅱ型電熱三用水浴箱（北京市醫療設備廠），MCO?15AC型CO2培養箱（SANYO公司），SW?LG?1F超凈臺（蘇凈集團安泰公司），CKX?41型倒置顯微鏡（OLYMPUS公司），KDC?220HR高速冷凍離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司），MiniOpticon型Real time PCR儀（BIO?RAD公司），ELx808酶標儀（BioTek公司），8道手動調節移液器（BIOHIT公司）。

1.3 方法

1.3.1 ATF的體外培養 取人體粘連組織，按照文獻［6］方法進行ATF的原代培養，取第3～5代細胞進行實驗。細胞培養條件：原代培養使用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基，傳代后胎牛血清含量改為10%，溫度37℃，CO2濃度5%，相對濕度95%。

1.3.2 CCK?8細胞活性實驗 收集生長狀態良好的ATF，經0.25%胰酶消化，以每孔5×103個的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，換成無血清培養基饑餓培養8 h，加入不同濃度TGF?β1（0、0.5、1、2.5、5、10、20、40、80 ng/mL），每個劑量組設6個復孔，培養24 h，移去原培養液后加入含10%CCK?8溶液100 μL，37 ℃，5%CO2培養箱中繼續培養3 h，用酶標儀測定450 nm處吸光度值（OD值）。根據結果計算各組的細胞活性。細胞活性（viability）=用藥組（OD值）/實驗組（OD值）×100%。

按上述同樣的方法接種ATF于96孔板，無血清培養基饑餓培養8 h后，加入10 ng/mL TGF?β1刺激6 h后，再加入不同濃度DSS（0、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L），每個劑量組設6個復孔，培養48 h，按同法測定各組的細胞活性。

1.3.3 Real?time PCR實驗 將ATF接種于直徑6 cm培養皿，每皿細胞數1×106個，經貼壁、同步化處理后，分為空白組、模型組與DSS 2.5、10、40 μmol/L組。除空白組外，各組均按10 ng/mL劑量加入 TGF?β1，培養 6 h，DSS各組按2.5、10、40 μmol/L劑量加入丹參素鈉，空白組與模型組加入等體積PBS，培養48 h。按試劑盒說明書進行操作，提取總RNA后逆轉錄為cDNA，置-20℃下凍存待用。根據NCBI提供的人體mRNA序列，用Prime Premier軟件設計內參β?actin與目的基因COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1的引物（表1），由上海英駿生物技術有限公司合成。按照SYBR?Premix Ex TaqTM中的25 μL體系進行Real time PCR檢測，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s，40個循環。記錄 CT值，采用2-ΔΔCT法計算各藥物組相對于空白對照組的 MMP?1、TIMP?1 mRNA表達倍數F。F=2-［（待測目的基因平均CT值-待測內參平均CT值）-（對照目的基因平均CT值-對照內參平均CT值）］。

1.3.4 ELISA實驗 收集各組細胞的培養上清液，按ELISA試劑盒上的說明書進行操作，檢測上清液中COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1的蛋白水平。

1.4 統計學方法 使用統計軟件SPSS 16.0對實驗數據進行方差齊性分析，各組間的差異采用單因素方差分析（One?way ANOVA），若方差齊性，組間差異比較采用LSD檢驗（Least?significant Differ?ence），方差不齊則采用Dunnett′s T3檢驗。

表1 Real?time PCR檢測用引物序列Tab.1 Primers of Real?time PCR

2 結果

2.1 TGF?β1與DSS對ATF細胞活性的影響 不同劑量TGF?β1下的細胞活性如圖1A所示，當濃度在5～10 ng/mL時細胞活性最高。在TGF?β1刺激下，DSS各劑量組的細胞活性如圖2B所示，DSS 2.5、5、10、20、40 μmol/L 組與0 μmol/L 組相比，差異無統計學意義（P＞ 0.05），DSS 80、160 μmol/L組的細胞活性低于0 μmol/L組，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。

圖1 TGF?β1與DSS對細胞活性的影響Fig.1 Effects of TGF?β1 and Danshensu on fibroblast viability

2.2 DSS對ATF COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1 mRNA表達的影響 各組ATF的COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1 mRNA水平如圖2A所示。One?way ANOVA結果顯示，各組的COL?Ⅰ、TIMP?1 mRNA水平差異有統計學意義（P＜0.01），MMP?1 mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）。LSD檢驗結果顯示：與空白組比較，模型組、DSS 2.5 μmol/L 組的 COL?Ⅰ、TIMP?1 mRNA水平上調，差異有統計學意義（P＜0.01），模型組與DSS 40 μmol/L組MMP?1 mRNA水平下調，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，DSS 2.5、10、40 μmol/L組的COL?Ⅰ mRNA水平下調，DSS 10、40 μmol/L組的TIMP?1 mRNA水平下調，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。

2.3 DSS對ATF COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1 蛋白表達的影響 各組ATF的COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1蛋白水平如圖2B～2D所示。One?way ANOVA結果顯示，各組ATF的COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1蛋白水平差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。LSD檢驗結果顯示：與空白組比較，模型組的COL?Ⅰ、TIMP?1水平升高，MMP?1水平下降，DSS 2.5 μmol/L的COL?Ⅰ水平升高，DSS 2.5、10、40 μmol/L組的MMP?1水平下降，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，DSS 10、40 μmol/L組COL?Ⅰ水平下降，DSS 2.5、10、40 μmol/L組TIMP?1水平下降，差異有統計學意義（P＜ 0.01）；DSS 2.5、10、40 μmol/L組MMP?1水平升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

術后粘連的產生與各種細胞、細胞因子、趨化因子、缺氧、缺血等腹腔微環境的改變密切相關［6］。文獻顯示，遷移到腹膜損傷處的成纖維細胞在TGF?β的誘導下發生過度增殖，同時引起膠原等細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積，最終形成不可逆的粘連［7］，TGF?β在腹腔液中的過度表達可導致粘連發生率提高［8］。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一類依賴于Zn2+的內肽酶，具有降解各種ECM成分的活性，其活性可被組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue me?talloproteinase inhibitors，TIMPs）抑制。兩者在細胞遷移、細胞增殖、ECM沉積與降解中起重要調節作用。DIAMOND等［9］認為MMP?1水平升高與TIMP?1水平降低能促進ECM降解，從而減少粘連發生，若MMP?1水平抑制與TIMP?1水平升高則ECM沉積，導致粘連增加。本研究據此選取ECM代表性成分COL?Ⅰ以及與其沉積與降解相關的調節蛋白MMP?1與TIMP?1為檢測指標，考察DSS對處于病理微環境下的ATF膠原合成與降解的影響。

本課題組在前期研究中將TGF?β1與人體ATF共培養，結果顯示TGF?β1在一定劑量范圍內可明顯提高ATF的增殖活性與COL?Ⅰ合成水平［10］。本研究結果顯示TGF?β1劑量在5～20 ng/mL時能提高ATF細胞活性，10 ng/mL TGF?β1可上調ATFCOL?Ⅰ、TIMP?1 mRNA 與蛋白水平，下調 MMP?1 mRNA與蛋白水平，表明該刺激劑量可模擬術后粘連形成的病理微環境，為本研究建立了體外模型。

圖2 各組COL?Ⅰ、MMP?1與TIMP?1的mRNA與蛋白表達Fig.2 COL?Ⅰ，MMP?1，TIMP?1 mRNA and protein expression in different groups

CCK?8實驗結果顯示DSS在2.5～ 40 μmol/L范圍內不影響ATF細胞活性，據此選擇2.5、10、40 μmol/L作為實驗劑量，以保證在同一細胞數量水平上考察DSS對ATF的影響。Real?time PCR與ELISA結果顯示DSS各劑量組COL?Ⅰ、TIMP?1 mRNA與蛋白表達水平低于模型組，同時DSS 10、40 μmol/L劑量組的COL?Ⅰ、TIMP?1表達水平與空白組無差異，提示DSS通過下調COL?Ⅰ表達抑制ATF膠原合成，下調TIMP?1表達促進ATF膠原降解，并將其COL?Ⅰ與TIMP?1恢復至無TGF?β1刺激的正常水平。本課題組的前期研究發現丹參另一個水溶性成分丹酚酸B對ATF也有類似作用：下調COL?Ⅰ、Fibronectin表達，同時促進MMP?9表達、降低TIMP?1活性，調節細胞外基質降解平衡［11］。丹酚酸B由3分子DSS與1分子咖啡酸縮合而成，結合本研究結果分析，丹酚酸B可能通過其水解產物DSS發揮對ATF膠原合成與降解的調控作用。

VERRECCHIA 等［12］發現 COL?Ⅰ、COL?Ⅲ、COL?Ⅴ等基因的表達受TGF?β/Smad3通路調控。近年的研究顯示，DSS可干擾TGF?β/Smad3信號通路，抑制缺氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖［13］；通過下調肝星形細胞TβRⅠ、TβRⅡ蛋白的表達，抑制其活化增殖，同時上調Smad7 mRNA表達，下調Smad2、Smad3 mRNA表達，抑制TGF?β誘導的肝星形細胞活化［14］；DSS還能減弱高糖刺激下腹膜間皮細胞COL?Ⅰ與fibronectin的蛋白與mRNA表達［15］。根據上述文獻以及本研究結果，筆者推測DSS通過調控ATF TGF?β/Smads信號轉導，降低ATF細胞外基質的過度沉積，從而減少粘連產生。今后我們將繼續考察DSS、丹酚酸B等丹參主要化學成分對TGF?β信號通路的影響，為闡明丹參防治術后粘連的分子藥理學機制提供更多理論依據。