OPG和RANKL在XACB/LV?bFGF/MSCs移植修復兔股骨頭缺損壞死模型中的表達

趙胤 彭吾訓 張健 董文濤 吳建華 張飛 張槐 王健波 葉川李青 鄧進

1貴州醫科大學（貴陽 550000）；2貴州醫科大學附屬醫院（貴陽 550000）

股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femo?ral head，ANFH）多見于20～50歲的中青年患者，是由于不同病因破壞了股骨頭的血液供應所造成的最終結果。目前公認的致病因素有13種［1］，這些致病因素破壞股骨頭的血液供應，最終導致股骨頭骨與軟骨細胞的壞死及關節面的坍塌，是臨床常見的疾病之一。目前針對股骨頭缺血性壞死有髓芯減壓術［2］、帶血管蒂游離腓骨移植［3］、人工髖關節置換等治療措施，但卻存在治愈率低、供骨區并發癥、人工關節使用壽命有限等缺點［4］。近年來，運用骨髓基質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植修復股骨頭缺血性壞死成為研究熱點，骨髓基質干細胞是多能干細胞，具有分化為成骨細胞的潛力［5］，而在誘導骨髓基質干細胞定向分化為成骨細胞的過程中，常用的細胞因子為堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）［6］。而骨保護素和核因子?κB受體活化因子配體作為破骨細胞分化和調節骨吸收的關鍵因子［7］，可直接影響破骨細胞功效，是骨質吸收的共同通路。本文就通過觀察移植了慢病毒轉染bFGF的MSCs復合培養的異種脫抗原松質骨（XACB/LV?bFGF/MSCs）治療兔股骨頭壞死模型中骨保護素和核因子-κB受體活化因子配體的表達變化情況，探討組織工程骨對股骨頭缺損壞死的治療效果，為將來骨組織工程的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～7月齡純種雄性新西蘭大白兔60只，由貴州醫科大學動物中心提供。

1.2 主要實驗試劑及儀器 兔抗bFGF多克隆抗體，兔抗OPG多克隆抗體，兔抗RANKL多克隆抗體（北京博奧森生物科技有限公司）；FGF?2基因過表達慢病毒和慢病毒陰性對照（上海吉凱基因有限公司）。

1.3 兔BMSCs分離培養及鑒定 以3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，在兔股骨遠端及脛骨近端穿刺，以預存肝素的注射器抽取骨髓液1～2 mL，采用密度梯度離心法分離細胞，完全培養基重懸，接種于25 cm2培養瓶中，置于5%CO2、37℃培養箱中培養。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態及貼壁情況，當細胞接近80%～90%融合時，加入胰酶按1∶3的比例消化傳代。細胞傳至第3代時，應用流式細胞儀檢測MSCs細胞表面標記物（CD44）的表達；采用成骨誘導培養基誘導MSCs成骨分化，于誘導培養第14天，應用ALP染色和茜素紅染色鑒定其成骨分化潛能。

1.4 組織工程骨的制備 用豬椎骨制成異種脫抗原松質骨（XACB）。分離培養兔骨髓基質干細胞（MSCs）并傳代培養，將兔bFGF基因通過慢病毒轉染至骨髓基質干細胞。將含兔bFGF基因的MSCs與XACB復合培養，制成組織工程骨XACB/LV?bFGF/MSCs。

1.5 建立兔股骨頭壞死模型 雄性新西蘭大白兔60只進行隨機分組，分為5組，每組12只，運用MATSUI等［8］的地塞米松聯合馬血清注射的方法進行造模。

1.6 實驗分組與組織工程骨的植入 造模結束后行MRI檢查，確認造模成功后均右側手術。將實驗動物隨機分為5組。A組為空白對照組，B組植入XACB，C組植入XACB+MSCs，D組植入XACB+MSCs+空病毒，E組植入XACB+LV?bFGF+MSCs。每組12只。A組復溫后立即逐層關閉切口，B、C、D、E、組復溫后沿向鉆孔內分別植入面積3 mm×3 mm×3 mm大小的XACB、XACB+MSCs、XACB+MSCs+ 空病毒、XACB+bFGF+MSCs，醫用凝膠海綿封閉創面，逐層關閉切口。術后各組動物臀大肌注射青霉素鈉（40萬U/d，連續3 d）預防感染。

1.7 Western blot法檢測慢病毒轉染的骨髓基制干細胞中bFGF蛋白表達水平 轉染之前將細胞分為3組，分別為實驗組（MSCs+LV?bFGF），空病毒組（MSCs+空病毒），空白組（單純MSCs）。轉染后將3組MSCs消化后提取蛋白，運用BCA法測定蛋白濃度，調節蛋白濃度一致后100℃煮沸10 min使蛋白變性。按照WB的實驗步驟進行操作，得出的圖像運用凝膠圖像處理系統分析圖像。

1.8 Western blot法檢測骨組織中OPG和RANKL蛋白表達水平 術后3、6、12周各組分別處死四只兔子，加入蛋白裂解液（按每100 mg骨組織加入200 μL裂解液）在冰上裂解骨組織，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清即為含有總蛋白的提取液。運用BCA法測定蛋白濃度，調節蛋白濃度一致后100℃煮沸10 min使蛋白變性。按照WB的實驗步驟進行操作，得出的圖像運用凝膠圖像處理系統分析圖像。

1.9 統計學方法 所有數據采用SPSS 22.0統計軟件包進行分析處理，采用均值比較和單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs的培養與鑒定 采用密度梯度離心法聯合貼壁培養法，獲得大量形態均一的MSCs，細胞呈旋渦狀生長，形狀呈長梭形、多角形。細胞表面抗原CD44檢測結果陽性率達99%以上；成骨誘導培養第14天，茜素紅、ALP染色均呈陽性。見圖1。

圖1 MSCs的培養與鑒定Fig.1 Culture and authentication of MSCs

2.2 LV?bFGF/MSCs中bFGF蛋白表達情況 各組bFGF蛋白表達結果見表1、圖2。實驗結果顯示：實驗組與空病毒組和空白組之間兩兩比較差異均具有統計學意義（P＜0.05），空病毒組與空白組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 LV?bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表達情況Tab.1 Expression of bFGF protein in LV?bFGF/BMSCs ±s

表1 LV?bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表達情況Tab.1 Expression of bFGF protein in LV?bFGF/BMSCs ±s

注：與實驗組比較，*P＜0.05；與空病毒組比，#P＞0.05

組別實驗組空病毒組空白組bFGF 0.580 2±0.002 2 0.224 7±0.008 2*0.212 8±0.017 5*#

圖2 LV?bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表達情況Fig.2 Expression of bFGF protein in lv?bfgf/BMSCs

2.3 骨組織中OPG蛋白表達情況 各組OPG蛋白表達結果見表2、圖3。實驗結果顯示：A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05），C組與D組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 骨組織中OPG蛋白表達情況Tab.2 Expression of OPG protein in bone tissue ±s

表2 骨組織中OPG蛋白表達情況Tab.2 Expression of OPG protein in bone tissue ±s

注：與E組比較，*P＜0.05；與D組比，#P＞0.05

組別A組（空白組）B組（XACB）C組（XACB+MSCs）D組（XACB+MSCs+LV）E組（XACB+LV?bFGF+MSCs）3周0.517 0±0.020 8*0.102 3±0.015 3*0.157 0±0.050 0*#0.160 7±0.055 1*0.182 7±0.047 3 6周0.057 1±0.001 4*0.106 3±0.005 8*0.160 3±0.005 0*#0.166 3±0.005 1*#0.200 7±0.006 0 12周0.069 0±0.001 0*0.113 3±0.002 3*0.163 7±0.003 2*#0.169 7±0.009 6*0.222 3±0.006 6

圖3 骨組織中OPG蛋白表達情況Fig.3 Expression of OPG protein in bone tissue

2.4 骨組織中RANKL蛋白表達情況 各組RANKL蛋白表達結果見表3、圖4。實驗結果顯示：A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。C組與D組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 骨組織中bFGF蛋白表達情況 各組bFGF蛋白表達結果見表4、圖5。實驗結果顯示：A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。C組與D組之間比較差異不具有顯著性（P＞0.05）。

表3 骨組織中RANKL蛋白表達情況Tab.3 Expression of RANKL protein in bone tissue ±s

表3 骨組織中RANKL蛋白表達情況Tab.3 Expression of RANKL protein in bone tissue ±s

注：與E組比較，*P＜0.05；與D組比，#P＞0.05

組別A組（空白組）B組（XACB）C組（XACB+MSCs）D組（XACB+MSCs+LV）E組（XACB+LV?bFGF+MSCs）L3周0.041 8±0.002 7*0.048 9±0.001 4*0.057 4±0.002 9*#0.056 8±0.005 5*0.076 2±0.004 1 L6周0.045 0±0.004 2*0.054 3±0.005 1*0.070 9±0.003 7*#0.075 0±0.001 9*0.093 5±0.004 4 L12周0.056 5±0.002 5*0.065 7±0.005 0*0.078 9±0.004 8*#0.078 8±0.005 0*0.107 0±0.005 2

圖4 骨組織中RANKL蛋白表達情況Fig.4 Expression of RANKL protein in bone tissue

3 討論

3.1 OPG/RANK/RANKL系統 骨頭生長、發育是一個高度依賴機體調節的過程。在細胞水平上依賴于促進骨骼生長的成骨細胞和促進骨吸收的破骨細胞之間的相互作用［9］。而 OPG、RANK、RANKL在此過程中發揮重要作用。OPG、RANK、RANKL系統是近年來發現調節骨代謝的重要通路，目前已作為主要的標志物廣泛用于骨代謝的研究［10］。OPG是一種生長因子受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族。OPG是RANKL的誘導受體，通過與RANKL的結合減少破骨細胞的產生。RANKL在成骨細胞中表達，激活破骨細胞。RANKL過表達，可導致一系列骨疾病，如風濕性關節炎、銀屑病性關節炎等。本實驗中，筆者通過對術后3、6、12周各時間點各組實驗動物骨組織中OPG及RANKL的蛋白表達變化情況來評價股骨頭壞死的修復效果。本實驗采用WB技術檢測術后3、6、12周各組實驗動物蛋白的表達情況，發現XACB/LV?bFGF/MSCs在術后各時間點使OPG表達上調（A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異均有統計學意義P＜0.05，C組與D組之間比較差異無統計學意義P＞0.05），術后各時間點RANKL蛋白的表達增高（A、B、C、D組與E組之間兩兩比較差異均有統計學意義P＜0.05，C組與D組之間比較差異無統計學意義P＞0.05），且OPG蛋白表達量高于RANKL蛋白表達量，實驗結果表明XACB/LV?bFGF/MSCs能夠有效促進股骨頭壞死的修復。

表4 骨組織中bFGF蛋白表達情況Tab.4 Expression of bFGF protein in bone tissue ±s

表4 骨組織中bFGF蛋白表達情況Tab.4 Expression of bFGF protein in bone tissue ±s

注：與E組比較，*P＜0.05；與D組比，#P＞0.05

組別A組（空白組）B組（XACB）C組（XACB+MSCs）D組（XACB+MSCs+LV）E組（XACB+LV?bFGF+MSCs）3周0.047 8±0.002 0*0.066 1±0.001 8*0.091 1±0.002 5*#0.095 0±0.003 7*0.121 3±0.005 5 6周0.129 3±0.011 1*0.143 7±0.007 3*0.164 3±0.003 5*#0.170 0±0.007 9*0.226 3±0.006 6 12周0.152 7±0.008 0*0.186 7±0.003 0*0.257 3±0.010 7*#0.259 0±0.015 1*0.318 3±0.014 1

圖5 骨組織中bFGF蛋白表達情況Fig.5 Expression of bFGF protein in bone tissue

3.2 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF） 即FGF?2，是一種促細胞分裂的肝素結合蛋白，可誘導多種細胞的增殖與分化，被認為是體內最為有效的促血管生成因子之一［11-12］。另外，bFGF還有促進毛細血管生長，促進新骨形成和替代的作用［13-14］。本實驗運用WB技術檢測慢病毒轉染后的骨髓基制干細胞中bFGF的表達情況，以此來驗證轉染后的MSCs中bFGF的表達量是否增高，實驗結果示實驗組、空病毒組和空白組均有bFGF蛋白表達，且為實驗組＞空病毒組＞空白組，實驗組與空病毒組和空白組之間兩兩比較差異均具有統計學意義（P＜0.05），空病毒組與空白組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗結果表明成功通過慢病毒將bFGF轉染至MSCs中。以上的實驗結果表明：本實驗成功地通過慢病毒將bFGF轉染至MSCs中，并且XACB/LV?bFGF/MSCs組對兔股骨頭缺損壞死模型的修復效果較其他組更優，有望作為一種有效的組織工程材料運用于股骨頭壞死修復中。

3.3 本實驗的局限性和不足之處 本實驗僅就慢病毒轉染bFGF的MSCs復合培養XACB對兔股骨頭壞死的修復效果進行了探索研究，并沒有進行相關的抑制實驗，同時本實驗僅針對實驗動物進行了研究，沒有對其在人體內的使用效果及作用機制進行研究，因此，下一步筆者還將進行相關的抑制實驗以及對XACB/LV?bFGF/MSCs在人體內的使用效果及作用機制進行進一步的探索研究。