炎癥性腸病相關結腸癌組織差異表達基因的篩選及驗證

徐曉晶， 余一祎， 王志明， 崔越宏， 侯英勇， 劉天舒*

1. 復旦大學附屬中山醫院腫瘤內科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院病理科，上海 200032

癌癥的形成是一個多因素、多步驟過程，慢性炎癥作為其中一個重要環節參與了10%～20%的癌癥發生，并與治療反應密切相關[1]。研究[2]證明，炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是某些結直腸癌發生發展的危險因素，包括潰瘍性結腸炎和克隆恩病。腸道炎癥引起致癌突變進而導致腸癌的發生。隨著對惡性腫瘤炎癥和免疫微環境認識的進展，IBD相關腸癌的基因組學特點及微生態菌群失調成為了目前研究的熱點。

IBD所致腸道炎癥的特點是中性粒細胞、巨噬細胞和其他免疫細胞特異性聚集，并釋放各種細胞因子、自由基和蛋白水解酶等，從而建立一個腫瘤形成所需的微環境[3]。研究[4]發現，IBD中細胞因子和生長因子的表達譜與結直腸癌有相似之處，包括腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23等。IBD的另一個特點是腸道菌群失調，如具核梭桿菌在結腸癌組織中富集并發揮重要作用[5]。但目前針對IBD相關腸癌發生的具體分子機制尚不清楚。

目前從炎癥到腫瘤的基礎和轉化研究主要利用動物模型[6]，而缺乏人群長期隨訪結果。因此，本研究采用3組IBD相關結腸癌患者的腫瘤組織和癌周組織進行二代測序，旨在探索炎癥相關性腸癌的基因組學特點，尋找并驗證差異表達基因，并對其富集的生物學功能進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年1月至6月就診我科因炎癥性腸病長期隨訪發現惡性結腸癌者3例，其中1例合并潰瘍性結腸炎，2例合并克隆恩病。男性2例，女性1例，中位年齡44歲。2例臨床分期為ⅡA期，1例為ⅢB期。3例患者均符合以下條件：(1)按WHO組織學分類標準，經病理學確診為結腸腺癌合并克隆恩病或潰瘍性結腸炎；(2)于2016年1月至6月行手術切除，具體時間分別為2016年2月16日、6月1日、6月15日；(3)手術標本行甲醛固定、石蠟包埋，室溫條件下保存，為盡量減少基因降解和損傷，標本均于半年內進行二代測序；(4)手術前未接受過放化療；(5)既往接受過氨基水楊酸制劑藥物治療，術前半年未接受激素或免疫抑制劑治療。

1.2 新一代測序及分析 取石蠟塊內部組織，使用切片機切割成5～20 μm切片，總量相當于80 μm。采用Ambion○RRecoverAllTM總核酸提取試劑盒提取RNA。用DNaseⅠ去除基因組DNA的污染，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑在Thermomixer中適溫將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應體系合成二鏈，并使用試劑盒純化回收、黏性末端修復、cDNA的3′末端加上堿基“A”并連接接頭，經片段大小選擇后進行PCP擴增。構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質檢，合格后使用Illumina HiSeq 2000平臺進行測序。過濾掉低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的數據，然后使用Bowtie2軟件和RSEM軟件計算基因表達水平。分析不同樣品間的差異表達基因，并根據KEGG注釋結果及官方分類，將差異基因進行功能分類和生物學通路富集分析。

1.3 建立炎癥性腸癌動物模型 采用BALB/c品系雄性小鼠，體質量18～20 g，6～8周齡，第1天腹腔注射氧化偶氮甲烷(AOM)10 mg/kg，予3%右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)自由飲用1周，后改為正常飲水2周，如此循環6次。

1.4 RNA抽提及RT-PCR檢測 將動物腫瘤組織和癌周組織剪成小塊在液氮中磨成粉末，采用TRIzol試劑提取組織內總RNA，測定純度及濃度。取1 μg RNA反轉錄成含cDNA的反應體系20 μL，稀釋10倍。每次取2 μL。使用SYBR Green進行RT-PCR反應。CST1前引物為：5′-CCG CAC CAT ATG TAC CAA GT-3′，后引物為：5′-CGT AGA TCT CGA AAG AGC ACA A-3′。SFRP4前引物為：5′-CAC AAC GGT GGT GGA TGT AA-3′，后引物為：5′- GTG GAC ACT GGC AAG AAG AA-3′。MSLN前引物為：5′-GTC AAC AAA GGG CAC GAA ATG-3′，后引物為：5′- AGG GTG TCT AGG GTG TCT TT-3′。TRIM29前引物為：5′-GGA GAC CAC CCA GAA GAA TTT-3′，后引物為：5′- GGC AGG TCA TT GTC AGA GTT-3′。CCL11前引物為：5′- TTC AGC GAC TAG AGA GCT ACA-3′，后引物為：5′- GAA TCC TGC ACC CAC TTC TT-3′。LTF前引物為：5′-GTG GTG TCT CGG ATG GAT AAG-3′，后引物為：5′- GGG CAG TCA GAT CCA TTT CT-3′。β-actin前引物為：5′-CGT GGG CCG CCC TAG GCA CCA-3′，后引物為：5′-TTG GCT TAG GGT TCA GGG GGG-3′。PCR擴增程序：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火及延伸20 s，循環數為45個。用RT-PCR儀自帶軟件分析，獲得擴增產物的Ct值，結果采用2-ΔΔCt法來分析mRNA的相對表達量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 12.0軟件，比較樣本間的基因表達量采用平均值的差異倍數(fold change)，倍數≥2倍且檢驗水準(α)為0.05。在富集分析時，對P值進行誤判率(FDR)校正，通常FDR≤0.01者視為顯著富集。FDR是錯誤發現率的簡稱，用于控制多重試驗中的Ⅰ型錯誤率。

2 結 果

2.1 采用FFPE標本進行測序的可靠性 各個樣本中質量值大于20的堿基數目占總堿基數目的比例(Q20)均大于99%，堿基含量分布以及質量分布均符合統計分析的要求。與參考基因組序列進行比對后，每個樣品的比對率均在80%左右，同時樣品間均勻的比對率表明樣品間具有可比性。

2.2 差異表達基因檢測 根據各個樣品基因表達水平結果，篩選出腫瘤組織和癌周組織間的差異表達基因。結果(表1)顯示：在腫瘤組織中的表達顯著上調的基因包括CST1、KRT80、SFRP4、MSLN等，顯著下調的包括SLC6A19、HGD、CCL11、LTF等。

表1 腫瘤組織/癌周組織前10位的差異表達基因

2.3 采用動物組織驗證差異表達基因 建立炎癥性腸癌動物模型后選擇其中6個基因(CST1、SFRP4、MSLN、TRIM29、CCL11、LTF)在動物組織中進行PCR驗證，結果表明除MSLN、CCL11外其他基因的表達趨勢與測序結果一致(圖1、圖2)。

圖1 在炎癥性腸癌動物組織中驗證差異表達基因

A，B：小鼠癌周組織H-E染色，可見正常腺體結構;C，D：AOM/DSS聯合誘導小鼠CAC模型標本H-E染色，可見典型惡性表現，如腺體緊密貼合、形成篩孔狀、腺泡內可見壞死.Original magnification: ×40 (A,C), ×200(B,D)

圖2 PCR驗證差異表達基因

2.4 Pathway功能分類和富集分析 KEGG生物通路分類和富集分析顯示，IBD相關的腫瘤組織與癌周組織間的差異表達基因共涉及112個通路，其中前10位的通路如表2所示。富集最多的通路集中于免疫性疾病、免疫系統感染性疾病和信號轉導等。其中，富集最明顯且包含差異表達基因最多的是原發性免疫缺陷相關通路(圖3)。

表2 前10位差異表達基因富集的通路 n(%)

圖3 Pathway功能富集圖

顏色代表Q值(顏色越白值越大，越藍值越小)，值越小代表富集結果越顯著;點的大小代表差異基因數目(點越大代表數目越多，越小代表數目越少)

3 討 論

IBD是一種自身免疫紊亂導致的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，是結直腸癌發生發展的重要危險因素。據報道，防治IBD的藥物如氨基水楊酸、維生素D等可能降低結直腸癌的發生風險[7-8]。由于缺乏長期隨訪的大規模前瞻性臨床研究，目前關于炎癥性腸病所致結直腸癌的研究主要基于動物模型。本研究采用回顧性的研究方式，對甲醛固定石蠟包埋臨床樣本進行測序。考慮到在制備和儲存過程中，FFPE樣品的DNA容易發生降解、損傷、分子或生物學修飾，因此本研究僅回顧性分析了半年內經手術切除的常溫保存的石蠟標本。結果表明，經數據過濾后，其堿基含量分布以及質量分布均符合統計分析的要求且樣品間具有可比性。因此，采用FFPE標本進行測序具備一定的可靠性。研究[9-11]證實，在新鮮組織難以獲得的情況下，FFPE標本可以作為備選方案進行新一代測序。

本研究通過對3例炎癥性腸病所致結腸癌患者的腫瘤組織和癌周組織進行測序，發現兩者間存在上萬個差異表達基因，涉及分子、細胞、生物過程等各個方面。進一步分類和富集分析提示，這些差異基因主要與人類免疫缺陷性疾病和感染性疾病相關。其次，信號轉導、運輸和代謝也起到重要作用。NF-κB、PI3K-Akt、鈣離子、B細胞受體、EB病毒感染等傳統信號通路也參與其中。本研究進一步總結了差異倍數前10位的基因，根據文獻報道挑選了6個基因在炎癥性腸癌動物模型的新鮮腫瘤組織和癌周組織中進行了PCR驗證。結果提示，除MSLN、CCL11外，其他基因的表達差異趨勢與測序結果一致。據報道，分泌型卷曲相關蛋白4(SFRP4)作為Wnt信號通路的調節劑，參與細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤形成過程[12]；MSLN編碼的間皮素作為細胞黏附蛋白，在多種腫瘤中呈現過表達[13]；人類宿主因子TRIM家族蛋白TRIM29通過抑制先天性免疫反應，從而促進鼻咽癌患者EB病毒持續性感染[14]；腫瘤相關鈣離子信號轉換因子2(TACSTD2)能夠編碼腫瘤相關性抗原，是一種參與鈣離子信號轉換的細胞表面受體[15]。上述基因的表達在IBD相關腫瘤組織中均呈上調趨勢。還有一些下調的基因，例如LTF編碼的乳酸轉鐵蛋白作為非特異性免疫系統的重要部分，參與宿主防御微生物感染、調節細胞生長和分化、阻止腫瘤形成和轉移[16-17]，其表達下調可能參與炎癥及腫瘤的形成。

目前，炎癥性腸癌動物模型一般采用致癌劑氧化偶氮甲烷(AOM)/致炎劑葡聚糖硫酸鈉(DSS)方法誘導。在炎癥至腫瘤的不同階段留取標本進行基因組學、蛋白質組學的研究簡單易行，但并不能準確反映人類炎癌的特征。研究模型成為了限制因素。隨著三維培養的發展，利用患者的自身腫瘤細胞，研究其與免疫細胞間的相互作用，并進行藥物篩選，能為實現個體化治療提供基礎。今后有待收集新鮮的人類組織標本，進行前瞻性隨機對照研究或組織學分析，以驗證本研究結論。