滇重樓種子檢驗規程研究△

李瑪，蘇鈦，李云，陳明瑋，邱斌，段麗*

(1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南白藥集團創新研發中心，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明 650111)

種子是最基本的生產資料，是育苗生產的物質基礎，開展中藥材種子檢驗規程和質量研究，制定種子檢驗規程和種子質量標準，能夠從源頭上保證中藥材質量的穩定可控[1]，是國家推進中藥標準化的一項重要任務。與農作物種子標準化的進程相比，中藥材的種子質量控制還非常落后，目前關于中藥材種子質量標準控制的工作已逐步展開，諸如三七[2]、射干[3]、青蒿[4]、遠志[5]等藥材的種子質量檢驗方法已見報道。

滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensisHand-Mazz.是百合科重樓屬多年生宿根性草本植物[6]，以干燥根及根莖入藥，藥材名重樓，它以重樓皂苷作為有效成分，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風抽搐等癥[7]。隨著市場對滇重樓藥材需求的不斷增加，野生資源已不能滿足市場對滇重樓藥材的需求，人工馴化種植工作正在逐步開展。滇重樓的主要繁殖方式有切塊繁殖和種子繁殖，對比兩種繁殖方式，切塊繁殖大量消耗藥材，且繁殖率低，而種子繁殖率高，可大規模提供種苗，能夠滿足當下滇重樓種植產業對種苗的需求。近年來對滇重樓的研究主要集中于化學成分的分析與測定、藥理作用、栽培繁育[8]方面，但對關乎種子質量的種子檢驗方法尚未見報道。因此，本研究對滇重樓種子的凈度、千粒重、真實性鑒定、含水量、生活力的檢測方法以及發芽條件進行系統的研究，以期為制定滇重樓種子檢驗規程和質量分級標準提供依據。

1 材料

滇重樓種子收集于云南省紅河州和文山州各滇重樓栽培區，經中科院昆明植物研究所李恒研究員鑒定為百合科重樓屬植物滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.的種子。

2 方法

2.1 扦樣

2.1.1 種子批 根據滇重樓種子的市場流通情況和送驗要求，確定滇重樓種子批的最大質量和送驗樣品的最小質量。

2.1.2 扦取送驗樣品和試驗樣品 按GB/T 3543.2-1995《農作物種子檢驗規程扦樣》的規定執行。樣品扦取后，干凈紙袋包裝，在室內陰涼干燥處保存。

2.2 凈度分析

按GB/T 3543.3-1995《農作物種子檢驗規程凈度分析》的規定執行。四分法從送驗樣品中扦取試驗樣品，并將其分成凈種子、其他植物種子和雜質3種成分，測定各成分的重量百分比，重復4次。

2.3 種子真實性鑒定

采用種子形態鑒定法。隨機數取種子100粒，重復3次，逐粒對大小、形狀、顏色和表面構造進行觀察并記錄。

2.4 千粒重測定

按GB/T 3543.7-1995《農作物種子檢驗規程其他項目檢驗》規定執行。分別采用百粒法、五百粒法、和千粒法進行測定。①百粒法：隨機從凈種子中數取100粒，重復8次，分別稱重，計算平均值、標準差和變異系數，變異系數(CV)<4.0%，測定值有效；②五百粒法：隨機從凈種子中數取500粒，重復4次，分別稱重，計算平均值、標準差和變異系數，變異系數(CV)<4.0%，測定值有效；③隨機從凈種子中數取1000粒，重復2次，分別稱重，計算平均值和重復間差數與平均數之比，重復間差數與平均數之比小于5.0%，測定值有效。

2.5 含水量測定

采用烘干減重法測定滇重樓種子含水量。按GB/T 3543.6-1995《農作物種子檢驗規程水分測定》規定執行。將用于盛裝樣品的小鋁盒預先烘干1 h(130～133 ℃)并置于硅膠干燥器中冷卻備用。分別采用高恒溫法和低恒溫法對種子含水量進行測定。①低恒溫法：分別在(103±2 ℃)低恒溫條件下，設置1、2、3、4、5、6、7、8、17 h計算種子水分損失量；②高恒溫法：分別在(131±2 ℃)高恒溫條件下，設置1、2、3、4、5、6、7、8、9 h計算種子水分損失量。每個處理3次重復，每次重復(5±0.001)g。

2.6 生活力測定

采用紅四氮唑(TTC)法測定種子生活力。

2.6.1 種子預處理 室溫條件下，蒸餾水浸種12 h后，沿種臍縱切種子，取半粒備用。

2.6.2 染色條件的確定 取上述備好的種子進行試驗：分別設置TTC溶液濃度為0.01%、0.05%、0.1%，染色時間為1、2、3、4、5、6、7、8 h，于30、35、40 ℃條件下對種子進行染色，每個處理3次重復，每個重復100粒種子。染色結束后，瀝去溶液，沖洗3～5次，觀察并計數。

2.6.3 滇重樓種子有無生活力標準建立 參照種子的發芽試驗結果，建立滇重樓種子TTC染色的鑒定標準。

2.7 發芽率測定

2.7.1 發芽前處理 自來水(ck)、無菌水、0.1%高錳酸鉀、1%次氯酸鈉各浸種10 min后，ck和無菌水浸種處理組直接置床，其余2處理組無菌水沖洗3次后置床，采用紙上法，置于20 ℃培養箱中黑暗培養，觀察種子污染率，每個處理50粒種子，3次重復。

2.7.2 適宜發芽床的確定 發芽床設3個處理：(1)紙上：培養皿中鋪2層充分吸濕的濾紙，將預處理的種子均勻置床；(2)砂上：將拌好的含水量為20%的濕砂在培養皿內鋪10 mm厚，種子均勻置床，(3)蛭石：將拌好的含水量為20%的蛭石在培養皿內鋪10 mm厚，種子均勻置床，培養條件為20 ℃黑暗培養，每個處理50粒種子，3次重復，觀察統計種子發芽情況。

2.7.3 適宜發芽溫度的確定 發芽床為紙上，發芽溫度設定為恒溫15、20、25 ℃，黑暗下培養，每個處理50粒種子，3次重復，觀察種子發芽情況。

2.7.4 光照對種子發芽的影響 以紙上為發芽床，于20 ℃恒溫條件下進行光照(12 h光照，12 h黑暗)和24 h全黑暗處理，每個處理50粒種子，3次重復，觀察種子發芽情況。

2.7.5 發芽計數時間確定 根據種子發芽表現，確定初次計數時間和末次計數時間。以胚根伸出種皮2 mm時的天數為初次計數時間，以種子發芽數達到最高時，以后再無發芽種子出現時的天數為末次計數時間。

2.7.6 結果統計 試驗結果以發芽率表示：

(1)

3 結果與分析

3.1 扦樣

滇重樓種子批的最大質量為2000 kg，凈度分析試樣是按至少含有2500粒種子推算而來，根據3.4結果，滇重樓種子千粒重為62.42 g，2500粒種子重量為187.26 g，所以確定滇重樓凈度分析試樣的最小重量為200 g，送驗樣品為凈度分析的10倍以上，最少為2000 g。

3.2 凈度分析

試驗中滇重樓種子均由所收集的果實洗去果皮并陰干表面水分所得，試樣均沒有其他植物種子，亦無雜質，凈度為100%。

3.3 真實性鑒定

滇重樓果實蒴果室背開裂，棕黃色；種子多數，種皮肉質多汁，櫻紅色，長：6.64～7.42 mm，寬：5.09～5.52 mm，厚：5.47～6.10 mm；除去假種皮后種子呈卵球形，種子堅硬，光滑，呈白色，長：4.85～5.97 mm，寬：3.75～4.65 mm，厚：3.53～4.65 mm；種子一側有黃白色圓形種臍。

3.4 千粒重測定

隨機選取經凈度分析后的滇重樓種子試樣進行測定，結果見表1。采用百粒法測定結果顯示變異系數(CV)大于4.0%，所以百粒法不適用于滇重樓種子千粒重的測定；根據結果顯示采用五百粒法及千粒法兩種方法測定時，測定值均有效，鑒于500粒法所用種子數量較少，因此，滇重樓種子適宜的千粒重測定方法為五百粒法。

表1 滇重樓種子千粒重測定

3.5 含水量測定

滇重樓種子含水量測定結果見表2。高恒溫烘干法中，1～6 h滇重樓種子水分不斷失去，是快速失水期，失去自由水；6～7 h水分散失減慢，是緩慢失水的時期，7～9 h水分散失顯著減慢，是較慢的失水期，失去分解水，失水量趨于穩定，烘干8 h與9 h之間無顯著差異；低恒溫烘干中，1～4 h滇重樓種子水分不斷失去，是快速失水期，失去自由水；之后水分散失減慢，是緩慢失水的時期；烘干17 h后種子含水量與高恒溫烘干8 h無顯著差異。因此，使用高恒溫烘干法烘干8 h測定滇重樓種子含水量。

表2 滇重樓種子水分測定

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P= 0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統計學意義。

3.6 生活力測定

3.6.1 染色條件的確定 滇重樓種子染色情況受染色的時間、溫度和染色液濃度的影響，生活力測定結果見表3。綜合染色時間、濃度及染色效果，在30 ℃、0.01%TTC溶液染色效果最好；并且染色7 h與染色8 h無顯著差異。因此30 ℃、0.01%TTC溶液中染色7h宜作為滇重樓種子生活力檢測的染色條件。

3.6.2 有無生活力鑒定標準的確定 滇重樓種子脫落時，胚極不發育，而是一個很小、未完全分化的多細胞橢圓體，肉眼很難觀察到滇重樓種子的胚，根據TTC染色法的原理，結合滇重樓種子的實際情況，有活力的滇重樓種子整個縱切面被TTC染為鮮紅色，染色均勻。滇重樓種子有無生活力鑒定標準如下，有活力的滇重樓種子：胚乳被TTC溶液染為鮮紅色或淺紅色，種子切面全部著色或大部分著色，染色均勻；無生活力的滇重樓種子：胚乳完全不著色或著淺色，染色不均勻；或局部著色，著色較淺。

表3 滇重樓種子生活力測定

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統計學意義。

3.7 發芽率測定

3.7.1 滇重樓種子發芽前處理 由表4可見，經過殺菌劑處理的滇重樓種子在試驗結束后種子的發芽率明顯高于ck，結果表明，在試驗前使用殺菌劑處理種子，能夠抑制霉菌污染，保證在試驗結束時有足夠的種子用于統計發芽率，提高計數的便利性。根據試驗結果，滇重樓種子發芽前出理方法為0.1%高錳酸鉀溶液浸泡10 min。

3.7.2 適宜發芽床的確定 由表5可見，紙上、沙上、和蛭石3種發芽床處理對滇重樓種子發芽無顯著的影響，均可作為滇重樓種子的發芽床，但考慮試驗操作的簡單性和觀察統計的便宜性，選取紙上作為滇重樓種子的最適發芽床。

表4 發芽前不同處理對滇重樓種子發芽率的影響

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統計學意義。

表5 不同發芽床對種子發芽率的影響

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統計學意義。

3.7.3 適宜發芽溫度的確定 在紙上黑暗培養條件下，20 ℃條件下種子發芽與15 ℃和25 ℃條件下種子發芽存在顯著差異。因此滇重樓種子適宜的發芽溫度為20 ℃。

表6 溫度對滇重樓種子發芽的影響

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統計學意義。

3.7.4 光照條件的確定 實驗結果如表7，種子在光照條件下和黑暗條件下發芽率存在顯著差異，所以滇重樓種子發芽時選擇全黑條件對其進行培養。

表7 光照對滇重樓種子發芽的影響

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統計學意義。

3.7.5 發芽計數時間的確定 種子置發芽床后第30 d胚根突破種皮約2 mm，以后種子逐漸發芽，第80 d后發芽速率明顯下降，100 d后，發芽基本結束，見圖1。

圖1 滇重樓種子發芽率與發芽時間的關系

因此，整個發芽計數時間在第30～100 d。因此滇重樓種子初次計數時間為30 d，末次計數時間為100 d。

4 結論與討論

市場滇重樓種子交易物為果實，需去除果皮及假種皮后方可播種，本研究中滇重樓種子是收集果實去除果皮后所得，凈度為100%，因此，質量檢驗規程中未考慮凈度分析。

目前，滇重樓種植面積在不斷擴大，各種植區間相互引種以及同屬植物種子摻入，是引起滇重樓種子混雜的原因，僅僅通過外觀形態觀測很難對種子真實性進行有效的鑒定，如果做田間鑒定則要到成苗期才能判斷，所需時間較長，筆者有意借助分子生物學手段對滇重樓種子進行鑒定，但具體方法有待進一步研究。

在進行滇重樓種子生活力檢測時，筆者分別運用TTC法和紅墨水法，實驗結果發現有活力的種子和通過沸水殺死的死種子均能被紅墨水染色，采用紅墨水法不能有效測定滇重樓種子生活力。因此TTC染色法是測定滇重樓種子生活力的有效方法。滇重樓種子成熟脫離植株時，胚極不發育，肉眼不可見，在制定滇重樓種子生活力測定的染色標準時，需要參照種子發芽率的測定結果。試驗結果顯示，以此方法測定的種子生活力越高，其對應種子的發芽率也越高，之后筆者對30個批次的滇重樓種子進行了生活力和發芽率的測定，其結果符合上述規律，證明TTC法測定滇重樓種子生活力方法可靠，鑒定標準成立，結果可信。

先前有學者報道，滇重樓種子具有形態-生理休眠特性，萌發速率慢，萌發率低等原因限制了滇重樓的人工栽培[9]，在本試驗中，筆者采用的實驗材料為剛從植株上取下去除假種皮后的新鮮種子，之后立即對種子進行處理，處理條件為20 ℃恒溫暗培養，結果發現處理30 d后種子開始發芽，100 d后發芽率可達97%以上。這表明，種子采收后立即給予合適的處理條件可以加快滇重樓種子胚形態的發育進程，縮短發芽時間，提高種子發芽率。滇重樓種子發芽進程緩慢，即使在適宜的條件下發芽周期亦長達100 d，在整個發芽進程中，要及時觀察發芽床的濕度，應保持發芽床始終保持濕潤。同時，培養箱內不能擺放過多的樣品，以免影響通風，使向內各處溫度不均衡從而影響種子發芽進程。

滇重樓生長緩慢，從種子到藥材一般需要5～8年的時間，對于后期滇重樓藥材質量標準的研究及劃分，以及不同等級的滇重樓種子對應的藥材質量等研究，需要后期更長時間的努力。

本研究從扦樣、凈度分析、真實性鑒定、含水量、千粒重等方面對滇重樓種子檢驗方法進行了研究，制定了適宜滇重樓種子的檢驗規程，見表8。

表8 滇重樓種子檢驗規程

筆者利用本研究建立的滇重樓種子檢驗規程，先后對30份滇重樓種子樣品進行檢測，盡管表明不同產地的種子，在發芽率、生活力等指標的測定結果有差異，但是方法穩定，廣泛適用于滇重樓種子質量的控制。所以此規程適用于滇重樓種子質量檢驗，能夠為中藥材滇重樓種子的規范化生產提供依據。