磁性固相萃取技術在測定大黃蒽醌類成分中的應用

殷召軍

(徐州市腫瘤醫院，江蘇 徐州 221005)

離子液，即我們通常所知的有機鹽，其熔點低于100 °C，通常包括有機陽離子(例如咪唑鎓鹽、吡咯鎓鹽、吡啶鎓鹽)和無機(或有機)的陰離子(例如四氟硼酸根、溴離子)[1-2]。自從1914年首次被發現后，離子液因其獨特的性能被各領域的研究人員進行各項考察研究。離子液的理化性能包括：低蒸汽壓、粘度和溶解度可調節、熱穩定性良好、不燃[3]。近年來，人們發現離子液在樣品萃取、光譜分析、三維測量、激光解吸/電離質譜分析和色譜分析等領域有良好的應用前景。當前，離子液對磁性材料進行功能化成為了一個熱門的話題，離子液對磁性材料進行有效的功能化，歸功于其陽離子結構和磁性材料表面的互動關系[4]。專家們預言，該材料在樣品的分離提取方面有較大的應用前景。

磁性固相萃取(Magnetic solid-phase extraction，MSPE)，利用吸附劑的順磁性，已經成功應用到各個領域，包括像生物、天然產物、食品以及環境水樣分析等[5]。與常規的固相萃取相比，磁性固相萃取其步驟更加簡潔，在減少吸附劑用量的同時，提取效果更好[6]。磁性固相萃取的成功，主要在兩方面：一方面，吸附劑均勻分散在樣品溶液中，而不是像固相萃取那樣擠入固相萃取柱中，這樣增加了吸附劑和目標分子的接觸，從而提高了提取效果；另一方面，在萃取結束后，吸附劑通過外加磁場環境的回收，使得吸附劑重復循環使用，無需經過過濾或者離心分離。此外，納米材料或磁性納米材料諸如石墨烯、石墨烯功能化四氧化三鐵這一類材料，具有較大的比表面積和獨特的理化性質，在磁性固相萃取領域倍受青睞[7]。然而目前，利用離子液將四氧化三鐵粒子進行功能化修飾，并將其作為吸附劑應用在固相萃取領域的案例，尚未有文獻報道。

大黃，多年草本植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim. ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的根或者莖。在中國或者其他國家，作為保健食品添加劑，同時在臨床上也作為一種常用的藥材，用于治療血栓和通便[8]。近年來的文章報道證明，蒽醌類衍生物因其藥理學活性和治療功效，是大黃中主要的活性成分[9-11]。本研究建立了一套以離子液包裹的四氧化三鐵作為吸附劑，以超高效液相色譜儀(UPLC)作為檢測手段，用于富集測定食品添加劑中的蒽醌類成分，包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚(圖1)。此外，本研究詳細考察了各類參數，包括離子液種類、離子液濃度、吸附劑濃度、稀釋液pH、洗脫液中的酸度。實驗結果表明，該方法能有效地用于大黃真實樣品的測定。

圖1 五個化合物的結構式

1 材料與儀器

溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑([C12mim]Br)、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑([C12mim]Cl)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(bminBF4)、1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸鹽(bminPSSA)，購于上海成捷化學有限公司；甲醇(色譜級)，購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；純凈水，購于徐州娃哈哈集團有限公司；其他所有化學試劑均為分析純，不經過進一步的凈化處理。磁性四氧化三鐵購于南京先鋒納米材料科技有限公司。

對照品蘆薈大黃素(批號：110795-200504)、大黃酸(批號：110757-200206)、大黃素(批號：110756-200110)、大黃素甲醚(批號：110758-200610)，均購于上海融禾醫藥科技發展有限公司；大黃酚(批號：0796-200208)，購于中國食品藥品檢定研究院。每種對照品純度均高于98%。大黃藥材及其制劑顆粒購于徐州當地藥店。

超高效液相色譜儀(UPLC，Waters Co.，Milford，MA，USA)，紫外檢測器(UV)

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：UPLC? BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm，Waters Co.)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫；流速：0.5 mL min-1；進樣：1 μL；波長：254 nm。梯度洗脫時間及比例：0～1 min，25%～30% B；1～3 min，30%～45% B；3～5 min，45%～60% B；5～7 min，60%～80% B；7～8 min，80%～100% B；8～8.5 min，100%～100% B。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各500 μg，大黃素甲醚250 μg的溶液；分別精密量取上述對照品溶液適量，按實驗所需濃度混勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

大黃樣品前處理方法參照《中華人民共和國藥典》2015版進行提取，所述提取方法為：將大黃藥材或大黃固體制劑粉碎，取粉末(過四號篩)0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲(功率100 W，頻率40 kHz)處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得大黃提取液。

2.4 磁性固相萃取步驟

1.5 mL規格離心管內加入20 μL對照品(或樣品)溶液、6.6 mg·mL-1MFMs分散液和0.32 mg·mL-1[C12mim]Cl溶液。隨后，加入1000 μL純水，快速渦旋10 s后靜置5 min。在離心管底部放入一塊磁鐵，持續1 s左右，將磁性粒子聚集。棄去上清液，用200 μL甲醇(含有1%乙酸)洗脫3次。收集洗脫液(共計600 μL)至新的離心管內，在80 ℃水浴環境中干燥。殘留物用50 μL甲醇溶解，超聲(功率100 W，頻率40 kHz)2 min，離心(13 000 rpm)5 min。最后，用UPLC對樣品進行定性定量分析，進樣體積為1 μL。

3 結果與討論

為了得到對目標分子最優的提取效果，本研究在接下來的正交試驗中，系統地考察了各項影響因素，包括離子液種類、離子液濃度、四氧化三鐵濃度、稀釋液pH。

3.1 離子液的選擇

本研究選取了4種離子液，分別為[C12mim]Br、[C12mim]Cl、bminBF4和bminPSSA，上述4種離子液分別包括不同的陰離子。實驗結果如圖2所示，選用長鏈離子液([C12mim]Br、[C12mim]Cl)的提取效果明顯優于選用短鏈離子液(bminBF4和bminPSSA)。可能的原因：首先，長鏈離子液的表面活性更接近傳統的陽離子表面活性劑，在水中溶解后，呈現兩性，長鏈離子液的陽離子基團具有烷烴長鏈，在功能化的過程中具有更高的分配比；其次，咪唑鎓鹽類離子液的存在增加了氫鍵以及其他弱作用力，使得離子液和四氧化三鐵以及目標分子相互作用更強烈；另外，[C12mim]Cl離子液中的氯離子其有最強烈的共軛和誘導效應，因此具有最高的紫外吸收。本研究還發現，加入離子液會使得最終的樣品溶液變黃色，在這些離子液中，[C12mim]Cl組所得溶液的顏色最深。結果證明，采用[C12mim]Cl的效果最佳，因此，在后續考察中，本研究統一采用[C12mim]Cl作為最優條件。

注：1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚。圖2 離子液種類考察結果

3.2 離子液濃度的影響

離子液濃度對提取效果和目標分子的作用部位均有重要影響。在考察時，離子液濃度范圍為0～0.48 mg·mL-1。結果如圖3所示，離子液[C12mim]Cl的濃度在0～0.32 mg·mL-1區間內時，所測得的蒽醌類物質的富集倍數從20變到60，且在0.32 mg·mL-1時達到最優。然而，當濃度增加到0.48 mg·mL-1時，提取效果驟減。盡管此時樣品分離良好，但結果表明此時目標分子和吸附劑之間的相互作用減少。此外，觀察實驗最后一步，所得結果的顏色均呈現黃色，尤其在濃度為0.32 mg·mL-1一組顏色最深。結果表明，提取效果受到離子本身多方面性質的綜合影響，例如范德華力、靜電引力和氫鍵等。在后續的考察中，均采用濃度為0.32 mg·mL-1的[C12mim]Cl離子液作為最優條件。

注：1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚。圖3 離子液濃度考察結果

3.3 四氧化三鐵濃度的影響

在磁固相萃取中，四氧化三鐵的濃度同樣是一項重要的參數，因為只有它直接和目標分子相接觸。在本項考察中，為了考察四氧化三鐵的吸附能力并最終得到最優的濃度，我們在稀釋液中加入0.32 mg·mL-1的離子液和20 μL大黃提取液，同時四氧化三鐵的濃度范圍在3.3～16.5 mg·mL-1，結果如圖4所示。當四氧化三鐵濃度增大到6.6 mg·mL-1時提取效果劇增，但當濃度變成9.9 mg·mL-1時提取效果下降，四氧化三鐵在分散體系中反而降低了磁固相萃取的效果。此外，濃度在9.9～16.5 mg·mL-1的每組數據，其紫外吸收響應差別并不大。此次考察結果證明，四氧化三鐵的吸附能力有飽和上限，在分散體系中具有高濃度的四氧化三鐵時，從分散體系中吸附目標分子變得困難。根據實驗結果，在后續的實驗考察中，采用6.6 mg·mL-1濃度的磁性材料。

注：1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚。圖4 四氧化三鐵粒子濃度考察結果

3.4 pH的影響

在提取環節，樣品提取液的pH值也是一項重要的因素，因為它決定了離子液的狀態。此外，在整個MSPE步驟優化中，pH也是一項關鍵的參數。在考察中，本研究采用1 mol·L-1的磷酸溶液或1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液將pH的范圍調節為5～13。pH對目標分子的提取效果影響如圖5所示。很顯然，當pH從5增加至11時，提取效果呈現遞增趨勢，尤其是大黃酸(峰2)和大黃酚(峰4)。可能由于目標分子屬于蒽醌類成分，其分子結構中存在羥基，羥基中的孤對電子和咪唑結構中的π電子相互作用，使得提取效果增加。然而，pH變成13后，目標分子的峰面積下降。這表明，強堿性環境下，目標分子和功能化磁性材料之間的相互作用會降低，最終影響提取效果。因此，pH選用11作為后續的考察條件。

注：1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚。圖5 樣品溶液pH考察結果

3.5 方法學考察

經過優化之后，本實驗系統性地考察了本技術方案的方法學參數，其中包括線性相關、精密度、重復性、檢測限(LODs)、定量限(LOQs)和回收率。結果詳見表1和表2。結果證明，本方案線性相關良好，相關系數r≥0.999 4。考察重復性時，我們進行了5組平行實驗，峰面積和保留時間的RSD值分別低于4.32%和0.46%。本方案的日內、日間精密度均在線性范圍內測定其RSD值。如表1所示，重復6次的日間精密度進樣結果，其峰面積和保留時間的RSD值分別在0.95%～1.19%范圍和0.18%～0.30%范圍內。而對于日內精密度，峰面積和保留時間的RSD值分別低于0.25%和0.66%。檢測限采用信噪比為3的結果，范圍是0.000 4～0.002 8 μg·mL-1。信噪比為10的定量限結果在0.001 4～0.009 4 μg·mL-1的范圍。本技術方案的回收率在89.25%～96.48%。上述結果表明本方案可以給目標分子提供一個良好的定量結果。

3.6 樣品分析

借助UPLC的基于離子液功能化的磁固相萃取技術，可用于提取測定食品添加劑中的蒽醌類成分。圖6展示了本研究涉及的色譜圖，包括標準品的色譜圖(圖6A)和樣品色譜圖(圖6B～E)。在沒有經過樣品前處理步驟(圖6B和6D)，大黃藥材和大黃顆粒制劑中的5類蒽醌類成分無法被儀器檢測(低于本方法的檢測限)。另一方面，經過磁性固相萃取后的目標分子能夠顯著提升儀器響應(圖6C和6E)，且互不干擾。據觀察，經過磁性富集后的目標分子提取效率明顯增大，富集倍數范圍在23倍(大黃素甲醚)到60倍(大黃素)之間。大黃藥材和大黃顆粒中的含量測定結果分別為：蘆薈大黃素 0.0146 mg·g-1和0.007 1 mg·g-1，大黃酸0.008 9 mg·g-1和0.004 7 mg·g-1，大黃素0.005 6 mg·g-1和0.002 4 mg·g-1，大黃酚0.141 1 mg·g-1和0.069 2 mg·g-1，大黃素甲醚0.033 4 mg·g-1和0.022 7 mg·g-1。很顯然，大黃顆粒中的蒽醌類成分低于藥材中的含量，可能由于加工過程中成分的損失。實驗結果表明，本方案可以有效用于分析測定天然產物中的多種活性成分。

表1 線性關系考察結果

表2 重復性、檢測限、定量限、回收率結果

注：1.蘆薈大黃素Aloeemodin；2.大黃酸Rhein；3.大黃素Emodin；4.大黃酚Chrysophanol；5.大黃素甲醚Physcion。圖6 樣品液相色譜圖

4 小結

綜上所述，一種新型的基于離子液包裹分散四氧化三鐵微粒的磁性固相萃取技術，并結合UPLC作為檢測手段的一套方案已經建立起來，用于富集檢測食品添加劑中的蒽醌類成分，目標分析物的含量可成功測定，并且各項方法學參數良好。相比較傳統的分析方法，本方法優點突出顯著，包括操作簡捷、迅速、高效、環保。因此，本方案在天然產物提取分析領域有良好的應用前景。