長鏈非編碼RNA FOXD2-AS1對卵巢癌細胞增殖和遷移的影響

卵巢癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響女性健康［1］。探討卵巢癌的發生、發展規律具有重要的意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的產物，與腫瘤的發生、發展密切相關［2］。lncRNA在卵巢癌組織中異常表達，lncRNA可能參與卵巢癌的發生、發展［3］。FOXD2-AS1是一種新發現的lncRNA，在多種腫瘤中高表達，對調控腫瘤進展發揮重要的作用［4-5］。因FOXD2-AS1在卵巢癌中作用的相關報道較少，本研究旨在通過檢測卵巢癌組織和細胞系中的FOXD2-AS1表達，通過下調卵巢癌HO-8910細胞中FOXD2-AS1的表達，探究FOXD2-AS1對HO-8910細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2017年2月至2017年9月華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院（武漢市婦幼保健院）手術切除的16例卵巢癌患者的組織標本，立即置于液氮保存，術后均經病理證實。該研究獲得本院醫學倫理委員會同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細胞與試劑 人正常卵巢上皮細胞系IOSE80、人卵巢癌細胞系（OC3、HO-8910、A2780、SKOV-3）均購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12培養液和胎牛血清（FBS）均購自美國Hyclone公司。小干擾RNA-FOXD2-AS1（siRNA-FOXD2-AS1正義鏈5'-GGCUUUUCCACUAGUUACUGA-3'，反義鏈 5'-AGU AACUAGUGGAAAAGCCCA-3'）和陰性對照RNA均購自上海吉瑪公司。Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司。RNA逆轉錄試劑盒及熒光實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative PCR，qPCR）試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。CCK-8試劑盒購自上海東仁化學科技公司。Transwell小室購自美國康寧公司。抗葡萄糖調節蛋白94（glucose regulated protein94，GRP94）、β-catenin、cyclin D1、c-myc、β-tubulin抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 IOSE80、A2780、SKOV-3細胞在DMEM/F12培養液中傳代培養，OC3、HO-8910細胞在RPMI 1640培養液中傳代培養，均含10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2培養箱。每日更換新鮮培養液，當細胞匯合度達70%時傳代培養。取對數生長期的卵巢癌HO-8910細胞接種于6孔細胞培養板中，當細胞匯合度達30%～40%時，嚴格按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉染操作，分別轉染siRNA（實驗組）和陰性對照RNA（對照組），24 h后更換新鮮培養液。

1.2.2 qPCR TRIzol法提取組織或細胞中總RNA，應用RNA逆轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA，應用qPCR試劑盒進行qPCR，以2-ΔΔCt法進行定量處理，以GAPDH為內參檢測FOXD2-AS1和GRP94 mRNA相對表達水平，以U6為內參檢測miR-150-5p相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 CCK-8法 取兩組對數生長期卵巢癌HO-8910細胞，培養液重懸調整細胞密度為1.5×105/mL，取20 μL/孔鋪于96孔板，分別于接種培養第1、2、3、4、5天，加入13 μL/孔CCK-8試劑，繼續培養4 h，吸去孔中培養液，加入100 μL二甲基亞砜，振蕩溶解結晶。酶標儀檢測490 nm波長的吸光度（A）值。

1.2.4 Transwell遷移實驗 取兩組對數生長期卵巢癌HO-8910細胞，無血清培養液重懸調整細胞密度為1.5×105/mL，取200 μL/孔加入Transwell培養板上室，將含血清的完全培養液以500 μL/孔加入Transwell培養板下室，培養箱培養24 h，取出Transwell培養板上室，甲醇固定，結晶紫溶液染色，棉簽擦去未穿過底膜的HO-8910細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野計數后取平均數。實驗重復4次。

1.2.5 生物信息學方法 應用starBase網站預測FOXD2-AS1可互補結合的微小RNA（microRNA，miRNA），在www.microRNA.org網站預測相應miRNA可互補結合的基因。

1.2.6 Western blot法檢測 取兩組對數生長期卵巢癌HO-8910細胞，裂解提取總蛋白，每組蛋白以30 μg上樣量應用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，應用硝酸纖維素膜轉膜，加入5%脫脂奶粉的封閉液封閉，加入一抗GRP94（1:1 000）、β-catenin（1:1 000）、cyclin D1（1:2 000）、c-myc（1:2 000）、β-tubulin（1:3 000），4℃過夜孵育，洗膜后加入二抗室溫孵育，化學發光法發光顯影，凝膠成像系統顯影。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。實驗數值以均數±標準差（）表示，組間均數比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXD2-AS1在卵巢癌組織和細胞中的表達

本研究采用qPCR檢測16例卵巢癌組織及正常癌旁組織中的FOXD2-AS1表達，結果發現FOXD2-AS1在卵巢癌組織相對表達量為8.56±0.51，明顯高于正常癌旁組織的2.38±0.21，差異具有統計學意義（t=11.27，P＜0.01，圖1）。進一步檢測不同卵巢癌細胞中的FOXD2-AS1表達水平，結果發現與正常卵巢上皮細胞IOSE80相比，FOXD2-AS1在不同卵巢癌細胞系中的表達均明顯增加（P＜0.05，圖2）。

圖1 FOXD2-AS1在卵巢癌組織和正常癌旁組織中的表達

圖2 FOXD2-AS1在正常卵巢上皮細胞和卵巢癌細胞系中的表達

2.2 FOXD2-AS1在卵巢癌HO-8910細胞中的表達

采用qPCR檢測顯示，在實驗組和對照組HO-8910細胞中的FOXD2-AS1相對表達量分別為0.29±0.06和1.01±0.07，差異具有統計學意義（P＜0.01），siRNA-FOXD2-AS1可有效降低HO-8910細胞中的FOXD2-AS1表達。

2.3 下調FOXD2-AS1表達對卵巢癌HO-8910細胞增殖活性的影響

采用CCK-8法檢測顯示，接種3天后，對照組HO-8910細胞吸光度明（A）值顯高于實驗組，提示下調FOXD2-AS1表達可抑制HO-8910細胞增殖活性（圖3）。

2.4 下調FOXD2-AS1表達對卵巢癌HO-8910細胞遷移能力的影響

采用Transwell遷移實驗檢測發現，對照組穿膜細胞數為（143.40±12.36）個/視野，明顯高于實驗組的（62.44±10.87）個/視野，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖4），提示下調FOXD2-AS1表達可抑制HO-8910細胞的遷移能力。

圖3 下調FOXD2-AS1表達對卵巢癌HO-8910細胞增殖活性的影響

圖4 下調FOXD2-AS1表達對卵巢癌HO-8910細胞遷移能力的影響

2.5 生物信息學方法對FOXD2-AS1互補結合的miRNA及下游基因預測

采用starBase和microRNA.org網站預測分析顯示，FOXD2-AS1互補結合miR-150-5p后可互補結合GRP94 mRNA，結合區域均為miR-150-5p的“AACCCUC”區域。

2.6 下調FOXD2-AS1對卵巢癌HO-8910細胞中miR-150-5p和GRP94 mRNA表達的影響

采用qPCR檢測顯示，對照組HO-8910細胞中miR-150-5p相對表達量1.01±0.08明顯低于實驗組的5.45±0.91，差異具有統計學意義（P＜0.01）；對照組HO-8910細胞中GRP94 mRNA相對表達量1.02±0.11明顯高于實驗組的0.32±0.05，差異具有統計學意義（P＜0.01）。提示下調FOXD2-AS1能夠增加miR-150-5p表達，減少GRP94 mRNA表達。

2.7 下調FOXD2-AS1對卵巢癌HO-8910細胞中的GRP94和Wnt/β-catenin信號通路蛋白的表達

采用Western blot法檢測發現，下調FOXD2-AS1表達后，GRP94蛋白表達降低，Wnt/β-catenin信號通路蛋白β-catenin、cyclin D1、c-myc表達降低（圖5）。提示FOXD2-AS1可能通過影響GRP94和Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達調控細胞增殖和遷移。

圖5 下調FOXD2-AS1對卵巢癌HO-8910細胞中GRP94和Wnt/βcatenin信號通路蛋白表達的影響

3 討論

lncRNA是一類轉錄本長度＞200個核苷酸的RNA，由于其不具有編碼蛋白的功能，起初被認為不具有生物學功能，是基因組轉錄的“噪音”［6］。近年來，大量lncRNA被發現在細胞周期中參與細胞增殖、遷移、凋亡等生物學過程，在多種腫瘤中均呈現異常表達，lncRNA在人類腫瘤發生、發展中起到重要作用［7］。lncRNA已成為繼miRNA后非編碼RNA研究領域的又一研究熱點［8］。lncRNA在卵巢癌中的作用日益引起研究者的廣泛關注。

Su等［5］研究發現，FOXD2-AS1在膀胱癌中表達上調，可促進腫瘤的進展，并與膀胱癌的復發密切相關。Bao等［4］研究發現，食管癌中FOXD2-AS1過表達與患者不良預后相關，可能是預測食管癌預后的生物標志物。Yang等［9］研究發現，FOXD2-AS1在結直腸癌中發揮癌基因的作用，促進腫瘤細胞的轉移。而FOXD2-AS1在卵巢癌中的研究尚少有報道。本研究結果表明，與正常癌旁組織和正常卵巢上皮細胞相比，在卵巢癌組織和細胞系中FOXD2-AS1表達均顯著增加，提示FOXD2-AS1基因可能在卵巢癌的發生發展中發揮癌基因的作用。為進一步研究FOXD2-AS1在卵巢癌中的生物學功能，本研究通過體外細胞實驗發現，在卵巢癌HO-8910細胞中FOXD2-AS1表達被抑制后，HO-8910細胞增殖活性和遷移能力降低，說明FOXD2-AS1可能主要通過促進細胞增殖和遷移參與卵巢癌的發生發展。

miRNA是lncRNA發揮作用的重要環節，lncRNA可作為結合miRNA的“海綿”，下調miRNA的表達發揮作用［10］。應用starBase網站預測顯示，FOXD2-AS1可互補結合miR-150-5p。Xia等［11］研究發現，miR-150-5p在卵巢癌組織中表達低于正常癌旁組織，下調miR-150-5p表達可促進卵巢癌細胞的增殖和轉移，miR-150-5p在卵巢癌中發揮抑癌基因作用。本研究發現，抑制FOXD2-AS1表達后，miR-150-5p表達增加。miRNA主要通過在轉錄水平抑制基因的表達發揮作用［12］。應用www.microRNA.org網站預測顯示，miR-150-5p可互補結合GRP94。本研究發現，miR-150-5p表達增加后，GRP94蛋白的表達降低。GRP94是一種高度保守的分子伴侶，在肝癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中呈高表達趨勢，可通過活化Wnt/β-catenin等多種信號通路，促進腫瘤的發生發展［13-15］。沉默GRP94表達可有效抑制腫瘤的增殖和遷移能力。本研究發現，GRP94蛋白表達降低后，Wnt/β-catenin信號通路蛋白β-catenin、cyclin D1、cmyc蛋白表達降低，提示Wnt/β-catenin信號通路轉導抑制導致卵巢癌細胞的增殖和遷移被抑制。

綜上所述，FOXD2-AS1在卵巢癌組織及細胞系中表達增加，下調卵巢癌HO-8910細胞中FOXD2-AS1表達可抑制卵巢癌HO-8910細胞的增殖活性和遷移能力，其作用機制可能是FOXD2-AS1靶向干擾miR-150-5p表達，進而影響GRP94基因的表達，調控Wnt/β-catenin信號通路的轉導。本研究為深入探索卵巢癌的發生、發展及治療新靶點提供了新的方向。