A2aR在彌漫大B細胞淋巴瘤組織和CD8+T細胞上的表達和預后價值的研究*

張婷婷 王先火 孟斌 任秀寶 張會來

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型，在臨床表現、免疫表型和分子遺傳學等方面具有高度異質性［1］。腺苷信號通路是近年來被證實的一種新型免疫逃逸機制。腫瘤細胞在乏氧條件下釋放核苷酸，核苷酸進一步由CD39/CD73水解為腺苷，游離腺苷與4個不同的G蛋白偶聯受體（A1、A2A、A2B和A3）結合發揮廣泛的免疫抑制作用，其中A2aR因其高親和力和廣泛表達而受到關注［2］。研究表明，阻斷A2aR可增強腫瘤浸潤淋巴細胞的活性，提高抗腫瘤免疫反應［3-4］。腫瘤源性的腺苷和抗腫瘤T細胞上A2aR表達參與多種腫瘤化療及免疫治療的耐藥［5-6］。目前，僅有少數研究報道A2aR在實體瘤中的表達及意義［3，7］，尚未見血液腫瘤中A2aR表達和臨床意義的研究。本研究旨在探索DLBCL中A2aR總表達和腫瘤浸潤淋巴細胞中CD8+T細胞上A2aR表達與患者臨床病理特征、預后之間的關系，為進一步研究DLBCL多重免疫逃逸機制和免疫治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2010年1月1日至2015年12月31日就診于天津醫科大學腫瘤醫院初治的72例DLBCL患者石蠟組織和臨床病理資料。所有患者均接受2個周期及2個周期以上類RCHOP方案治療。患者年齡為17～84歲，平均年齡為（52.5±14.2）歲；其中男性39例（54.2%），女性33例（45.8%）；生發中心B細胞（germinal center B cell，GCB）亞型31例（43.1%），非生發中心B細胞（nongerminal center B cell，non-GCB）亞型35例（48.6%），未分類6例（8.3%）。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑 石蠟組織4 μm切片，采用多重免疫組織化學法檢測DLBCL組織中A2aR、CD8的表達。兔抗人A2aR、CD8多克隆抗體購自英國Abcam公司；Opal多染試劑、HRP兔二抗、blocking buffer均購自美國Perkin Elmer公司。

1.2.2 實驗原理 多重免疫組織化學技術是在原免疫組織化學基礎上，采用二抗上帶有的HRP催化加入體系的非活性熒光素，熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近目的蛋白上的酪氨酸殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后微波處理，非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素還留存在樣品上（熒光素不受微波處理影響，并能在抗體去除后保留信號），微波處理之后可進行下一個蛋白的染色。

1.2.3 實驗步驟 取新鮮標本，10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片；將組織切片放置在70℃恒溫箱中烘烤2 h，二甲苯、梯度乙醇浸片；將玻片浸泡于250 mL抗原修復液中，置于微波爐中（高火至液體沸騰，調至低火，維持15 min），室溫自然冷卻；滴加blocking buffer，保濕孵育10 min；滴加CD8抗體（稀釋濃度1∶1 000），4℃冰箱過夜；滴加HRP兔二抗，保濕孵育10 min；滴加opal 520，保濕孵育10 min，TBST沖洗玻片；將玻片浸泡于250 mL抗原修復液中，置于微波爐中，重復上述步驟，滴加A2aR抗體（稀釋濃度1∶3 500）、HRP兔二抗、opal 620；滴加DAPI、封片。

1.2.4 結果判讀 采用Mantra成像系統進行圖像采集，每張切片采集20個200倍視野。應用Inform軟件進行蛋白定量、定位分析。A2aR陽性定義為≥1%的細胞出現細胞膜著色。

1.3 隨訪

通過查閱門診、住院病歷及電話進行隨訪，隨訪日期截至2017年4月。所有患者均獲得隨訪，中位隨訪時間為35（4～83）個月。預后評價指標為OS，定義為確診至患者死亡（完全數據）或末次隨訪的時間（截止數據）。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學分析。A2aR表達與DLBCL患者臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗，預后分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 DLBCL組織及CD8+T細胞上A2aR表達

72例DLBCL患者中，A2aR總表達陽性率為41.7%（30/72），陰性率為58.3%（42/72），A2aR陽性和陰性表達的比較見圖1。CD8+患者有58例，其中CD8+T細胞上A2aR表達陽性率為27.6%（16/58），CD8+T細胞上A2aR表達陰性率為72.4%（42/58），CD8+T細胞上A2aR的表達見圖2。

2.2 A2aR總表達與患者臨床病理特征之間的關系

χ2檢驗結果顯示，A2aR總表達與患者分期、IPI評分、Ki-67、β2-MG、B癥狀相關（P＜0.05，表1）。

2.3 CD8+T細胞上A2aR表達與患者臨床病理特征之間的關系

χ2檢驗結果顯示，CD8+T細胞上A2aR表達與患者分期、結外受累數目、IPI評分、Ki-67、β2-MG、B癥狀、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）相關（P＜0.05，表2）。

2.4 A2aR總表達與患者預后的關系

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，A2aR陽性組患者OS較陰性組較差（P＜0.05，圖3）。A2aR陽性組患者中位OS（median OS，mOS）為53.5（95%CI：41.4～65.5）個月，而A2aR陰性組患者mOS為69.0（95%CI：60.9～77.1）個月。隨訪期間，A2aR陰性組8例（19.0%）死亡，A2aR陽性組13例（43.3%）死亡。

圖1 A2aR染色結果（×200）

圖2 CD8+T細胞上A2aR的表達

2.5 CD8+T細胞上A2aR表達與患者預后的關系

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，CD8+T細胞上A2aR陽性組患者OS較陰性組顯著更差（P＜0.001），且生存曲線比定位A2aR總表達患者生存曲線分離更加明顯（圖4）。A2aR陽性組患者mOS為34.8（95%CI：22.2～47.5）個月，而A2aR陰性組患者mOS為76.2（95%CI：69.8～82.5）個月。隨訪期間，A2aR陰性組中4例（9.5%）死亡，A2aR陽性組中11例（68.8%）死亡。

表1 A2aR總表達與患者臨床病理特征之間的關系

表1 A2aR總表達與患者臨床病理特征之間的關系 （續表1）

表2 CD8+T細胞上A2AR表達與患者臨床病理特征之間的關系

圖3 A2aR總表達與患者總生存期之間的關系

圖4 CD8+T細胞上A2AR表達與患者總生存期之間的關系

3 討論

A2aR屬于新型第二代免疫檢查點分子，是腫瘤微環境CD8+T細胞表面主要的免疫檢查點受體之一，可抑制T細胞上TCR誘導的NF-κB信號通路，抑制IL-2、IL-4、IFN-γ分泌，從而誘導效應T細胞功能失活［5］。A2aR上調T細胞表面其他免疫檢查點，如PD-1、LAG-3等［8］表達，共同介導腫瘤免疫逃逸。此外，A2aR在腫瘤微環境其他免疫細胞，如NK細胞、巨噬細胞等均有表達，通過多種途徑發揮協同免疫抑制作用［2］。目前，關于A2aR蛋白在腫瘤中的表達及臨床意義研究較少。Ma等［3］研究發現，在頭頸鱗狀細胞癌中A2aR表達與患者病理分級、腫瘤大小和淋巴結轉移相關，表明A2aR表達水平與頭頸鱗狀細胞癌惡性程度密切相關。在非小細胞肺癌中，A2aR表達與患者性別、吸煙、病理分類相關，A2aR表達越高，患者預后越好，目前尚無解釋［7］。A2aR在不同腫瘤中表達及預后價值并不相同。本研究分析了A2aR在DLBCL中表達情況和臨床病理特征之間的關系。A2aR總表達與患者分期、IPI評分、Ki-67、β2-MG相關；A2aR+組患者OS較A2aR-組患者差，表明A2aR可能是DLBCL患者不良預后因素之一。CD8+T細胞作為腫瘤浸潤淋巴細胞中效應毒性T細胞，對腫瘤細胞具有直接殺傷作用［9］。T細胞表面多重免疫檢查點的表達可通過不同信號通路抑制T細胞活性，進而抑制機體的抗腫瘤免疫反應［10］。本研究分析了CD8+T細胞上A2aR表達與患者臨床病理特征及預后的關系。A2aR+CD8+與患者分期、IPI評分、β2-MG、Ki-67、LDH、結外受累數目、B癥狀相關，A2aR+CD8+組患者OS較A2aR-CD8+組患者更差。相比A2aR總表達，定位CD8+T細胞上A2aR表達可更好地評價DLBCL患者的預后。

綜上所述，A2aR的免疫治療已顯示出潛在的臨床應用價值。A2aR抗體（PBF-509）聯合PD-1抗體治療非小細胞肺癌的臨床Ⅰ/Ⅰb期試驗（NCT02403193）正在開展。此外，動物實驗表明，聯合A2aR抗體可以降低免疫相關不良反應的發生頻率［2］。A2aR有可能成為DLBCL淋巴瘤中新的免疫治療靶點，并有望聯合其他免疫檢查點抗體應用于臨床，從而進一步提高患者的療效。