幽門螺桿菌感染與胃癌中PRC2和H3K27me3的表達關系*

張寧 曾智 閻麗萍 楊珂 孫慶文 黃鵬

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，發病和死亡人數約占世界的50%［1］，其發病機制復雜，涉及多基因和多因素的共同作用，其中幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）感染與胃癌發生存在密切的關系，但其作用機理目前尚不明確。多梳抑制復合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是一組轉錄抑制因子，其核心成分果蠅zeste基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）具有組蛋白甲基轉移酶活性，通過對組蛋白H3進行甲基化修飾，從而導致腫瘤的發生發展。目前，有關HP感染是否影響表觀調控因子PRC2的表達尚缺乏報道。本研究采用免疫組織化學法檢測胃癌組織中PRC2家族蛋白和組蛋白H3K27me3的表達情況，分析HP感染與上述蛋白表達的相關性，探索HP感染在胃癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 選取復旦大學附屬上海市第五人民醫院2014年1月至2017年10月行胃癌手術的84例患者，其中男性55例，女性29例，平均年齡53歲。所有患者術前未經任何抗腫瘤治療且術后均得到明確的病理診斷。本研究通過醫院倫理委員會審查［批號：（2017）倫審（060備）］，所有患者簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 HP快速尿素酶法檢測試劑盒購于山東博邁達生物科技有限公司；DNA提取和PCR試劑盒購自天根生化科技公司；免疫組織化學試劑盒購自福州邁新公司；EZH2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，SUZ12、EED和H3K27me3抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 取手術切除的胃癌組織并在距癌灶5 cm處取癌旁組織。胃癌標本分成3份，1份經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，制片，用于HP染色和免疫組織化學檢測；1份用于快速尿素酶檢測；1份置于-80℃冰箱保存用于PCR檢測。

1.2.2 HP快速尿素酶檢測 新鮮胃黏膜（1 mm3）取樣后立即置于加有底物反應液的試管內，充分震蕩，室溫靜置5 min，觀察試管內液體顏色。如果呈黃色，為陰性；如果呈淺紅色～玫瑰紅色，為陽性。

1.2.3 HP染色 采用改良的Giemsa染色法檢測HP。石蠟切片脫蠟至水，置于0.5%鹽酸酒精中10 min，充分水洗后將切片置于Giemsa工作液中經微波爐加熱2～4 min。然后用1%冰醋酸快速浸洗，水洗，脫水，透明，封片。

1.2.4 PCR檢測 1）組織DNA提取：將凍存的胃組織剪碎、勻漿，加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），55℃水浴1 h完全消化后按照試劑盒說明書操作，提取DNA進行純度測定；2）引物設計：針對VacA基因設計引物如下：F'：5-GGAGCCCCAGGAAACATTG-3'，R：5'-CTGCTTG AATGCGCCAAAC-3'。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；3）PCR反應條件：反應總體積為50 μL，上、下游引物各2 μL，應用Touchdown PCR方法擴增基因，94℃預變性4 min，94℃變性0.5 min，自65℃～50℃每降3℃循環3次，最后1個溫度循環15次，所有循環結束后，72℃延伸10 min。

1.2.5 免疫組織化學法檢測 石蠟切片脫蠟至水，微波修復抗原10 min，PBS洗滌，3%過氧化氫孵育20 min。山羊血清37℃封閉30 min，洗滌，分別滴加兔抗人EZH2抗體（1:200）、SUZ12抗體（1:100）、EED抗體（1:200）和鼠抗人H3K27me3抗體（1:100），4℃過夜。PBS洗滌后，分別滴加羊抗兔和兔抗鼠二抗工作液，溫箱中孵育30min。滴加辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素，孵育30 min，DAB顯色，終止反應。結腸癌和乳腺癌組織（由上海健康醫學院基礎醫學院病理教研室收集與提供）用作陽性對照，陰性對照用PBS替代一抗。

1.2.6 免疫組織化學結果判讀 隨機選取5個高倍鏡視野（×400），計數腫瘤細胞總數和陽性細胞數，計算陽性細胞百分比，以≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分；對染色強度進行計分，無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項得分相加，≥3分定義為陽性，＜3分定義為陰性。所有切片均由兩名病理醫生獨立閱片和判讀。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計數資料以百分率（%）表示，PRC2家族和H3K27me3蛋白的表達，以及與HP感染和臨床病理資料之間的關系采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HP檢測結果

84例胃癌患者，HP快速尿素酶檢測法檢出率為70.24%（59/84）。Giemsa染色顯示胃黏膜細胞胞質呈粉紅色，胞核呈藍色或紫色，HP呈淡藍色或藍色，彎曲狀或弧形（圖1A），HP檢出率為61.90%（52/84）。電泳結果顯示，VacA基因擴增電泳條帶分子量為353 bp（圖1B），PCR檢測陽性率為76.19%（64/84）。3種檢測方法中任一結果為陽性者均判為陽性。

2.2 PRC2家族和H3K27me3蛋白在胃癌組織中的表達

PRC2家族中3個成員EZH2、SUZ12和EED以及H3K27me3蛋白在胃癌組織中的表達均定位于細胞核，為棕黃色顆粒（圖2A～D）。EZH2、SUZ12、EED和H3K27me3蛋白在胃癌組織的陽性表達率分別為79.76%（67/84）、77.38%（65/84）、40.48%（34/84）和69.05%（58/84），均顯著高于癌旁組織（22.60%、34.52%、8.33%和14.29%），差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。

2.3 EZH2和H3K27me3蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系

本研究分析了EZH2和H3K27me3蛋白表達與胃癌臨床病理指標的關系，發現EZH2和H3K27me3的表達與淋巴結轉移相關，發生淋巴結轉移的病例EZH2和H3K27me3蛋白表達均顯著高于無淋巴結轉移的病例（P＜0.05，表2），與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、Lauren分型、分化程度、TNM分期和生存時間均無顯著相關性。

2.4 胃癌組織中PRC2和H3K27me3蛋白表達與HP感染的關系

在HP陽性胃癌組織中，EZH2、SUZ12、EED和H3K27me3蛋白的陽性表達率分別為89.06%（57/64）、84.38%（54/64）、46.88%（30/64）和82.81%（53/64），均顯著高于HP陰性胃癌組織（50.00%、55.00%、20.00%和25.00%，P＜0.05）。差異具有統計學意義（P＜0.05，表3）。

2.5 胃癌組織中EZH2與H3K27me3蛋白表達的關系

胃癌組織中，67例EZH2表達陽性的病例中H3K27me3蛋白陽性表達率為74.63%（50/67），17例EZH2表達陰性的病例中H3K27me3蛋白陽性表達率為47.06%（8/17），前者顯著高于后者，差異具有統計學意義（P＜0.05），EZH2與H3K27me3蛋白的表達呈正相關（表4）。

圖1 HP檢測結果

圖2 PRC2家族蛋白和H3K27me3在胃癌組織中的表達（SP法×40）

表1 PRC2家族蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達

表2 EZH2和H3H27me3蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系

表2 EZH2和H3H27me3蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系（續表2）

表3 PRC2和H3K27me3蛋白在HP陽性及陰性胃癌組織中的表達

表4 胃癌組織中EZH2和H3K27me3蛋白表達的關系

3 討論

近年來，中國胃癌的發病率不斷升高，在胃癌高發地區，成人HP感染率超過56%［2］。HP致癌機制與尿素酶造成的胃黏膜屏障損傷、空泡細胞毒素（VacA）和細胞毒素相關蛋白（CagA）引起的基因突變和免疫反應有關。有研究發現，HP感染可顯著提高水通道蛋白（Aquaporin 3）和缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）表達，使人胃癌細胞AGS和GES-1活性氧含量增加，加重胃黏膜上皮細胞損傷［3］；還可以調節環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和15羥基前列腺素脫氫酶（15 hydroxy prostaglandin dehydrogenase，15PGDH）表達進而使前列腺素E2水平上升［4］；此外，還可通過轉錄因子NF-κB上調miR-223-3p表達，進而抑制其下游靶基因ARID1A表達，促進胃癌細胞增殖和轉移［5］。MABK通路中EGFR、RAF和MERK等分子在HP感染時表達上調，進而引發高胃泌素血癥［6］。HP感染還可通過miR-181b激活IL-6/STAT3信號途徑，進而抑制尾型同源盒轉錄因子（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）表達和p53信號通路，導致胃癌預后不良［7］。目前，有關HP致癌機制的研究雖然取得了一定進展，但仍未完全闡述清楚，特別是HP感染是否影響表觀調控因子的表達。本研究通過分析HP感染與胃癌組織PRC2家族蛋白和組蛋白H3K27me3表達的相關性，尋找其可能的致癌機制。

PRC2是一組轉錄抑制因子，核心成分EZH2基因位于7q35，其編碼產物能對組蛋白進行甲基化修飾，維持下游靶基因沉默，從而誘導腫瘤的發生發展。多項研究表明，EZH2在惡性腫瘤中表達上調，并與腫瘤的侵襲和轉移相關，是預后不良的指標［8-13］。本研究結果顯示，EZH2蛋白在胃癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織，且與淋巴轉移相關，這與既往文獻報道相一致［12-13］。Chen等［14］研究表明，EZH2在胃癌組織中高表達，且與腫瘤的大小、浸潤深度、轉移及臨床分期有關，本研究發現上述因素與胃癌組織中EZH2的表達均無顯著相關性。Mattioli等［15］研究發現，EZH2表達水平與腫瘤類型有關，在腸型胃癌中的表達明顯高于彌漫型胃癌。本研究結果顯示，EZH2的表達水平與胃癌Lauren分型無關。EZH2單獨存在時不具有組蛋白甲基轉移酶活性，需要在PRC2家族另外兩個成員SUZ12和EED的共同參與下構成復合物，才能發揮酶活性。由此可見，SUZ12和EED對于維持復合物結構的穩定性和EZH2的酶活性是必需的［16-18］。有研究報道，SUZ12在結直腸癌、肝癌和乳腺癌中表達均上調［19-20］。本研究對SUZ12和EED蛋白的表達進行分析，結果表明胃癌組織中SUZ12和EED蛋白的表達率顯著高于癌旁組織。

組蛋白是染色質的基本組成單位，尾部某些氨基酸殘基發生修飾后可以改變染色質的結構，從而影響基因的表達。組蛋白H3的N末端賴氨酸殘基K27（H3K27）是最常見的甲基化修飾位點，三甲基化修飾后的組蛋白H3K27me3能抑制下游靶基因的轉錄，從而調控基因的表達。有關H3K27me3蛋白在腫瘤中的表達水平和臨床意義的報道不盡相同，在肝細胞癌和膀胱癌中表達上調且預后不良［21-22］，而在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中表達均下調，且與預后不良相關［23］。作為EZH2的甲基化修飾對象，本研究對H3K27me3蛋白的表達進行分析，結果顯示該蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，且與淋巴結轉移相關。

本研究對胃癌組織中PRC2家族蛋白表達與HP感染的相關性進行分析，結果顯示該家族蛋白在HP陽性胃癌組織中的表達顯著高于HP陰性胃癌組織，提示HP感染不僅與PRC2家族核心成員EZH2表達上調呈正相關，還與該家族中另外兩個成員SUZ12和EED表達上調也相關。進一步分析HP感染與胃癌組織中H3K27me3蛋白表達的關系發現，H3K27me3在HP陽性胃癌組織中的表達顯著高于HP陰性胃癌組織，且與EZH2蛋白表達呈正相關，提示HP感染與H3k27me3蛋白的表達相關。

綜上所述，HP感染與胃癌組織中PRC2和H3K27me3蛋白表達上調相關，這為闡述病原體對宿主轉錄調控的影響提供了新的證據，也為探索HP致癌機制提供了新思路。但HP是否直接影響胃癌細胞中PRC2的表達，尚需進一步研究證實。