獼猴脊髓損傷研究長時程麻醉方案的建立及評價

馬小翠，唐 濤, 2，劉少君

(1.中國醫科大學腫瘤醫院，遼寧省腫瘤醫院，沈陽 110042； 2.軍事科學院軍事醫學研究院基礎醫學研究所神經生物學教研室，北京 100850)

獼猴(Macacamulatta)作為常用的非人靈長類模式動物，因其在生理、代謝以及解剖結構等許多生物學特性上與人存在高度相似性，被越來越多的應用于醫學研究[1]。由于獼猴是一種具有攻擊性的大型實驗動物，在進行實驗操作過程中，常常需要使其進入鎮靜或麻醉狀態，來保證實驗的順利進行和實驗人員以及實驗動物的安全。隨著獼猴被更多地應用于復雜醫學實驗，傳統的麻醉方案，如速新眠、氯胺酮以及復合型成品麻醉劑舒泰等已很難滿足長時程實驗操作的需求[2-6]。為配合獼猴脊髓損傷模型建立及損傷修復實驗，本研究基于臨床常用的麻醉方案，結合實驗動物特點，設計了一套簡單易行且安全有效的獼猴麻醉方案，并對這一方案進行觀察和評價。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年普通級雄性獼猴10只，體重4.5 ～ 5.5 kg，年齡4 ～ 6歲，購自河北省正定縣龍威獼猴飼養場[SCXK (冀) 2010-1-007]。實驗動物飼養于軍事醫學科學院實驗動物中心[SYXK (軍) 2012-0065]，單只分籠飼養，籠舍配有層流凈化設施，12 h晝夜交替，室溫22℃ ～ 23℃，相對濕度40% ～ 45%，可自由獲取食物及飲用水。飼養及實驗嚴格遵守軍事醫學科學院非人靈長類動物實驗規范(IACUC-2015-016)。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷(50 g，山東科源制藥有限公司，批號151201)；丙泊酚注射液(20 mL，廣東嘉博制藥有限公司，批號X140811-2)；硫酸阿托品注射液(2 mL，天津藥業集團有限公司，批號15110504)。口咽通氣道[ISO SIZE 5.5，英特賽克醫療器械(常州)有限公司]；麻醉面罩(ISO SIZE 3，VBM Medizintechnik GmbH)；小動物麻醉機(Surgivet 100 Smith Medical PM, Inc.)；心電監護儀(PM-900A+，湖南省瑞博科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物術前用藥及麻醉誘導

實驗動物于手術前10 h禁食水，麻醉前30 min給予硫酸阿托品注射液0.5 mL(0.25 mg)肌肉注射。麻醉誘導時，用移動背板將獼猴固定于籠門處，頭皮針連接5 mL注射器于肘窩行靜脈穿刺，緩慢推送丙泊酚注射液(6 mg/kg)誘導麻醉，遵循先快后慢的原則，藥物推入約60% ～ 70%時，獼猴會出現躁動，繼續緩慢給藥，待全部藥物推入后拔除頭皮針，局部棉球按壓，防止出血。獼猴進入麻醉狀態，檢查生命體征是否平穩，有無呼吸抑制現象。如無異常，給予臀大肌肌肉注射0.5 g頭孢曲松鈉注射液。放置于轉運箱內轉運至手術室。

到達手術室后將獼猴俯臥位置于手術床上，頭置于頭圈內偏向左側(麻醉機放置于左側)，口腔內放置口咽通氣道，面罩通氣。四頭帶固定面罩，異氟醚吸入維持麻醉(初始體積濃度2.0%，氧流量2 L/min)。檢查右側耳朵有無壓迫，面罩有無移位、漏氣，腹下放置棉墊，減輕膝關節壓力，固定四肢，連接監護儀(血氧探頭置于左耳外耳廓，心電圖電極分別放置于雙肩及右下肢，體溫探頭置于口中，血壓袖帶綁于右上臂)，監護心率、血壓、脈搏、血氧飽和度等生命體征。

1.3.2 麻醉維持

手術室操作過程中保持異氟烷吸入麻醉，根據刺激強度調整異氟醚體積濃度(1.0% ～ 2.5%)。

1.3.3 脊髓損傷模型建立

行后正中直切口(T11～ L2)，逐層切開皮膚、皮下組織，沿棘突兩側剝離最長肌，暴露椎板，咬除T12～ L1棘突，叼除T12下部椎板、L1上部椎板及T12～ L1間韌帶。顯微鏡下縱行切開L1 ～ 2硬脊膜并懸吊，雙極電凝脊髓后正中靜脈，小圓刀銳性橫斷脊髓，形成脊髓完全橫斷損傷，雙極電凝脊髓前正中靜脈及前外側靜脈，顯微剪刀離斷，脊髓斷端自然收縮，形成一3 mm間隙。徹底止血，生理鹽水沖洗硬膜囊，無活動性出血，嚴密縫合硬腦膜防止腦脊液漏。逐層縫合肌肉及皮下結締組織，皮膚吻合器閉合皮膚切口，敷料包扎固定。

1.3.4 麻醉喚醒

停用異氟醚，保留氧氣，流量5 L/min，必要時吸痰管吸出口腔分泌物。獼猴清醒后，檢查肌力、肌張力及病理反射，確認生命體征穩定后，放置于轉運箱轉運至動物中心。

1.3.5 觀察指標

記錄麻醉誘導時間、麻醉維持時間以及麻醉蘇醒時間。持續監測血氧飽和度(SpO2)、呼吸頻率(RR)、心率(HR)，并記錄麻醉前(T0)、麻醉后10 min(T1)、手術開始時(T2)、脊髓損傷造模時(T3)、皮膚縫合時(T4)以及麻醉蘇醒睜眼后(T5)生命體征數據進行分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 麻醉誘導

麻醉誘導時間短、起效快(3.11±0.53) min，無明顯呼吸及循環抑制。

2.2 麻醉維持

實驗過程中，實驗動物鎮靜充分，鎮痛效果好，無體動，肌肉松弛良好，能夠滿足后正中入路脊髓暴露要求，基本生命體征平穩(表1、圖1)，血氧飽和度和呼吸頻率各時間點間比較差異無顯著性(P> 0.05)；心率隨麻醉時間改變而有所改變(P< 0.05)，但各時間點心率兩兩之間比較差異無顯著性(P> 0.05)。麻醉維持時間(5.62±0.33) h。

表1 血氧飽和度(SpO2)、呼吸頻率(RR)、心率(HR)變化Table 1 Changes in blood exygen saturation (SpO2), respiratory rate (RR) and heart rate (HR)

注：T0：麻醉前；T1：麻醉后10 min；T2：手術開始時；T3：脊髓損傷造模時；T4：皮膚縫合時；T5：麻醉蘇醒睜眼后。

Note. T0: Preanesthesia; T1: 10 min after anesthesia; T2: At the beginning of surgery; T3: At the time of spinal cord transection; T4: At the time of skin suture; T5: Waking and eyes opening after anesthesia.

注：A：獼猴麻醉誘導后基本生命體征；B：獼猴脊髓全橫斷損傷造模脊髓橫斷時生命體征；C：獼猴術后縫合皮膚時生命體征。圖1 獼猴術程生命體征Note. A: Vital signs of the macaques after anesthesia induction. B: Vital signs of the macaques during spinal cord transection. C: Vital signs of the macaques during skin suturing.Figure 1 Vital signs of the macaques during the operation

2.3 麻醉蘇醒

麻醉蘇醒時間(9.22±2.31) min，全部實驗動物均于蘇醒后安全返回動物中心，無一例發生麻醉意，麻醉效果達到實驗設計要求。

3 討論

實驗動物麻醉的效果直接影響到實驗動物的安全和實驗操作的順利與否[7]。獼猴是一種非常機警、靈活的非人靈長類實驗動物。對獼猴進行造模及實驗驗證手術條件要求高、投入大，一旦出現術中麻醉減淺、動物體動，極易造成實驗失敗。

目前獼猴實驗麻醉常用以氯胺酮、巴比妥類、右美托咪定以及市售復合麻醉藥舒泰為主[2, 5-6]。氯胺酮、巴比妥類只針對短小手術操作，麻醉方式多為肌肉注射，誘導時間過長，維持時間短，為維持足夠的麻醉時間，術中需要不定時地追加藥物，無法維持平穩的麻醉深度，且隨著麻醉時間的延長，容易造成藥物蓄積，術后蘇醒時間長，易造成實驗動物死亡。右美托咪定等雖然可以利用微量泵進行持續靜脈注射以進行長時間麻醉，但麻醉深度不足以完成損傷較強的操作。有研究使用丙泊酚靜脈持續泵注進行獼猴麻醉得到了很好的效果[8-9]，丙泊酚起效快、作用時間短、安全范圍大、可操作性強，但因為獼猴四肢皮膚薄，皮下結蹄組織松弛，且覆蓋毛發，即使術前進行備皮仍會留存一層絨毛，血管留置通路不易于固定及長期維持。

近年來，吸入麻醉逐漸在動物實驗中得以應用。異氟醚有很強的麻醉效能，其血/氣分配系數低，麻醉深度易于調節。在獼猴脊髓損傷模型手術中，脊髓暴露過程及入路關閉過程刺激強度大，需要足夠的陣痛強度及麻醉深度。脊髓損傷過程刺激強度小，但手術操作在顯微鏡下進行，操作精細，要求實驗動物無體動，異氟醚良好的肌松作用可以保證手術操作的順利進行，這是其它靜脈麻醉藥無法比擬的。在保留自主呼吸時，吸入麻醉藥可以產生負反饋效應，自動維持麻醉深度在較安全的水平。通常脊髓損傷模型手術需要6 h左右，異氟醚化學性質穩定，在機體內生物轉化極少，幾乎全部以原型從肺排出，長時間應用無蓄積，可以為手術提供充足的時間。且吸入麻醉操作簡便，可重復性強，避免了反復追加藥物造成的麻醉深度波動以及藥物蓄積。操作結束后蘇醒快，沒有躁動，有利于對模型進行早期評價。麻醉劑吸入途徑包括氣管插管、氣管切開和面罩吸入等。考慮到面罩吸入麻醉方式較插管麻醉方式易于操作，避免氣管插管對獼猴的強刺激和對氣道的損傷，本研究采取了面罩麻醉方式，且得到了良好的效果。由于選用的是面罩吸入方式，會有手術室污染的弊端，但可以通過選用適合獼猴面部曲線的面罩，達到封閉麻醉呼吸管路的目的(筆者根據獼猴面部大小及形狀選取了#2或#3麻醉面罩)，麻醉廢氣通過活性炭麻醉廢氣回收裝置進行回收可達到減輕麻醉氣體對手術室空氣的污染。

丙泊酚與異氟醚復合麻醉方式適用范圍寬，丙泊酚靜脈麻醉可以較容易地滿足動物籠舍誘導麻醉、短時間麻醉方式下檢查(如X線、MRI等)以及轉移不同操作場地(手術室、籠舍及檢查場所)的要求。

異氟醚吸入麻醉可以達到較長時間手術鎮靜、鎮痛及肌松的要求，可根據不同操作刺激強度調整麻醉深度，保證實驗動物生命體征平穩。本實驗中，獼猴的血氧飽和度和呼吸頻率在整個實驗過程中一直保持穩定，心率在手術操作期間較操作前和蘇醒后有所下降，正是由于研究者根據操作刺激強度調整麻醉深度所致，是麻醉達到預定效果的表現。停止異氟醚吸入后10 min內實驗動物即蘇醒，利于實驗早期的效果評價以及術后護理。丙泊酚與異氟醚聯合使用根據實驗要求隨時進行轉換，這樣既避免了丙泊酚靜脈留置泵入的不穩定性，又可以避免異氟醚麻醉需要氣源等設備不易移動的缺點。

綜上所述，以丙泊酚進行麻醉誘導，異氟醚吸入維持麻醉，可有效保證實驗動物生命體征平穩，易于根據刺激強度快速調節麻醉深度，鎮痛、鎮靜及肌松效果好，術后蘇醒快、不良反應少，是獼猴長時程手術操作所需的簡單易行、安全高效的麻醉方案。