輪蟲在生態毒理學中的研究進展

沙婧婧，戴媛媛，潘玉龍，李娟，徐兆東，張繼民,*

1. 國家海洋局北海環境監測中心，青島 266033 2. 國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評估技術重點實驗室，青島 266033 3. 山東省海洋生態環境與防災減災重點實驗室，青島 266033 4. 天津渤海水產研究所 中國水產科學院渤海研究中心，天津 300457

海洋浮游動物是海洋生態系統的重要組成部分，其群落結構的多樣性和穩定性對海洋生態系統影響甚遠。輪蟲(Rotifera)是海洋生態系統中最主要的次級生產者之一，起著關鍵性的承上啟下作用，自身所獨具的眾多優勢特征頗有研究前景，其生活周期短，且具有兩性生殖方式，具有對毒物的敏感性、超強的實用性和培養的簡易性，已經成為研究水生生態學、物種形成、進化與性別演變、種群動力學以及生態毒理學重要的模式生物[1]。經濟合作與發展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)將輪蟲視作無脊椎動物中進行環境毒性測試最有前途的分類群[2]。因此，針對污染物對輪蟲的生態毒理效應進行探討研究對于海洋生態系統的修復和保護具有重要意義。

在過去的幾十年里，國內外學者對輪蟲在環境污染物及其他脅迫因素下的實驗研究大幅增加，尤其在它們的生態功能、地理系統發育、基因組學領域以及行為、生理生化和分子響應方面，展開了一系列的研究[1,3-8]。作為水生浮游動物的主要種類，輪蟲的生態毒理學研究獲得較大發展，特別是學者們[4-5,9]開始更多地關注對輪蟲的分子和生理生化水平的影響，并取得了一些成果。通過基因表達的分析使得學者們能夠更深入地掌握毒性效應的分子機制。輪蟲可以作為毒物及其代謝產物風險評估的有用工具，且能通過其發現毒物最終進入水生生態系統的方式。在內分泌干擾方面，相比于橈足類和枝角類，輪蟲對雄激素和抗雄激素物質特別敏感[10-11]。且相對于橈足類和枝角類等水生浮游動物，輪蟲具有實驗周期短、成本低等優勢。總體來說，對輪蟲的生物毒性測試和基因表達研究相結合，讓我們能夠更加全面地了解污染物作用的毒性機制。本綜述的目的是為了界定在生態毒理學研究中，輪蟲作為重要的水生無脊椎動物模式生物的特征和潛能。本文對輪蟲在生態毒理學研究中的應用情況進行綜述并加以展望，以期為輪蟲在生態毒理學研究中的應用提供參考和拓寬思路。

1 輪蟲的特點及其生活史(The characteristics and life history of rotifers)

1.1 輪蟲的特點

輪蟲是一種微小的多細胞動物，有些種類營底棲、附著或固著生活，無游泳能力或游泳能力極弱、有些種類則營浮游或兼性浮游生活，在水中自由游動。輪蟲身體不分節，但具有兩側對稱的特征，具有假體腔，因此大多數動物學家將輪蟲歸屬為假體腔動物(Pseudocoelomata)。根據輪蟲胚胎發育過程和超微結構的差異，輪蟲動物門(Rotifera)可分為單巢綱(Monogononta)、雙巢綱(Digononta)和尾盤綱(Seisonidea)，單巢綱分游泳目(Ploima)和簇輪蟲目(Flosculariacea)，大約有90%的輪蟲屬于單巢綱。輪蟲屬于后生水生生物，在17世紀后期的列文·虎克時期即被人了解，通常體長在100 ～ 1 000 μm之間，最小的僅有40 μm左右，最大的可達到4 mm，迄今已知約2 150種[12]。

輪蟲由于個體較小，培養所用的水體體積小，甚至可以用微升加以培養，因此可用很微量的測試物來進行毒理學評價。輪蟲雌雄異體，雄性個體小，僅有纖毛環和精巢，專為有性生殖交配。雌性較為常見，個體大。輪蟲的內部器官比較齊全，具備神經、消化、排泄、生殖等器官系統，如圖1所示。輪蟲最主要的三大特征為：輪盤、咀嚼器和原腎管。根據以上特征，就能夠明顯地將輪蟲與其他水生動物區別開來[13]。

作為受試生物，輪蟲在生態毒理學研究中具有比其他浮游動物更明顯的優勢，能夠作為水質變化的敏感的生物指示物。這些優勢包括個體體型較小、世代時間短、生殖速度快、能縮短毒性試驗時間、對很多有毒物質都具有較強的敏感性、主要進行孤雌生殖、培養技術易行、具有較高的種群密度和種群增長率等，詳見表1所列。輪蟲屬全球分布，實驗材料可得性強，且輪蟲休眠卵已能進行商業化生產，同批次得到的休眠卵能使試驗材料基本生理狀況保持一致，減小實驗誤差。休眠卵能夠存儲較長時間，可在需要的時候隨時孵化進行生態毒理學實驗。這些特征使得輪蟲被作為評估環境污染物對生態環境影響的重要模式生物。

輪蟲分布廣、繁殖快、大小適中、易培養，是水產養殖中常用的動物性餌料，目前廣泛應用于生產性培養的是褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)[12]。輪蟲是中上層水體中魚類和其他經濟動物的理想開口餌料，雖然它們體型微小，但因為其龐大的種群規模，以及快速增長的高周轉率和一定條件下的孤雌生殖，大大增加了其在水生系統中的次級生產力。輪蟲由于其高代謝活動，可以從浮游生物和顆粒有機質中高效率再生得到營養作為食物[23]，因而在水生態系統的結構組成、物質循環和能量傳遞過程中具有重要的作用。輪蟲對毒物的敏感性強，且生命表簡單，能大大縮短試驗時間，從而減輕勞動強度和降低成本。實驗表明，利用輪蟲2 d種群增長研究環境毒物的影響，可與網紋溞(Ceriodaphniaquadrangula)7 d生命表測試相當，且靈敏度更高，而實驗人員勞動強度和資金投入僅占使用網紋溞作為受試生物的70%[16]。國外學者Persoone和Janssen[24]發現輪蟲對殺蟲劑的毒性敏感性比大型溞(Daphniamagna)更加敏感。美國和一些歐洲國家已經把褶皺臂尾輪蟲和萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)作為海水和淡水中污染物的生態毒理受試生物，用于監測化工和農藥生產廠家排放污水的毒性。此外，運用不同種類的輪蟲進行毒性試驗也可作為適合生物測試系統的一個綜合性多層次的方法[25]。

1.2 輪蟲的生殖方式及生活史

褶皺臂尾輪蟲的生殖方式有孤雌生殖和有性生殖2種，2種生殖方式可交替進行。輪蟲雌體在適宜的生態條件下均進行孤雌生殖，所產的卵不需要受精，立即發育孵化為雌體，這種卵稱非混交卵(又名夏卵)，產非混交卵的雌體稱非混交雌體。非混交雌體和非混交卵的細胞核中都含有雙倍的染色體；當環境條件惡化時，如饑餓、密度過高、缺氧、水質突變等，一些輪蟲開始進行有性生殖。有性生殖過程具有實現基因重組，增加種群遺傳多樣性特點，這有助于提高輪蟲種群對環境變化的適應能力。其世代周期短，繁殖速度快，能在較短時間里獲得實驗所需要的數量，可快速進行輪蟲生命表研究、進行種群參數分析。非混交雌體所產的卵在成熟前經減數分裂，卵細胞核內的染色體為單倍體，這種卵稱為混交卵，未經受精的混交卵發育為雄體，經受精的混交卵稱受精卵(又被稱為冬卵或休眠卵)[26]。休眠卵一端有空隙，體積比夏卵大，卵殼厚，一般呈橘黃色，其有厚的卵殼保護，能抵抗干燥、低溫、高溫或水質變化等不利的環境條件，且具有應對污染物脅迫較強的抵抗力。休眠卵沉到水底待休眠期滿且溫度、溶氧、滲透壓等水質環境條件適宜時才發育孵化出非混交雌體[1, 12-13]。

2 輪蟲在常規毒性評價中的應用(Application of rotifers in conventional toxicity evaluation)

最常用的常規的毒性評價實驗方法有2種：即急性和慢性毒性試驗。急性毒性實驗是研究在較短時間內毒物對輪蟲的毒性效應，一般以存活率作為指標；而慢性毒性實驗是在急性毒性實驗的基礎上進行的，當毒物在特定時間內對輪蟲的毒性較小時，其毒性作用可能是緩慢的，一般不會在短時間內使其致死，只是導致其機體的生理生化和行為異常，但最終的結果會使其出現生長發育遲緩、繁殖量下降、雌雄比例變化、個體死亡、種群密度下降等癥狀[1]。目前，在常規毒性實驗評價中，對于淡水污染物評價最常應用的受試生物是萼花臂尾輪蟲，海水污染物評價則多用褶皺臂尾輪蟲。美國試驗材料學會(American Society for Testing and Materials，ASTM)(ASTM，1991)也已將萼花臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲分別作為淡水和海水的標準測試生物[27]。

圖1 輪蟲雌體模式圖[14]注：a.頭冠纖毛；b.前棘刺；c.原腎管；d.肌肉；e.咀嚼器；f.食道；g.胃；h.被甲；i.伸縮泡；j.后棘刺；k.足；l.趾。Fig. 1 Structure pattern of female rotifer[14]Note: a. corona cilia; b. front caltrops spine; c. nephridial canal; d. muscle; e. trophi; f. esophagus; g. stomach; h. carapace; i. contractile vacuole; j. back caltrops spine; k. foot; l. toe.

2.1 急性毒性實驗

輪蟲急性毒性實驗最初主要致力于對致死率的研究。急性毒性實驗通常用半數致死濃度(LC50)作為首選的實驗終點，并在輪蟲實驗中廣泛使用[28-29]。國外學者首先展開了一系列對輪蟲的急性毒性實驗研究。1989年，Couillard等[30]測定了6種重金屬離子對萼花臂尾輪蟲的24 h-LC50；1991年，Snell等[31]以萼花臂尾輪蟲為受試生物，通過測定24 h-LC50，對多達28種化學物質進行急性毒性評估；1992年，Fernandez等[32]對多種農藥進行了急性毒性評價，測定了甲基對硫磷、殺草丹、馬拉硫磷、硫丹、二嗪農對萼花臂尾輪蟲的24 h-LC50；1994年，Liber等[33]通過12 h 和24 h 急性毒性實驗，研究了2，3，4，6-四氯酚和五氯苯酚對矩形龜甲輪蟲(Keratellaquadrala)和萼花臂尾輪蟲的毒性作用。從以上研究可以看出，輪蟲致死率測試終點多集中在24 h。由于輪蟲生命周期短，生殖速度快，短時間內會產出下一代，這會在一定程度上對結果的準確性產生很大的影響。因此，目前多采用24 h-LC50作為輪蟲急性毒性測試的實驗終點，而探索易于操作并能適當延長試驗周期的輪蟲毒性試驗方法仍然具有重要的生態毒理學意義。1999年，金解敏等[34]研究了銅、鋅離子對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性作用，為我國輪蟲毒理學的發展奠定了基礎，但與國外相比，還存在較大差距；2007年，謝欽銘等[35]研究了孔雀石綠、高錳酸鉀和甲醛3種藥物對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性，結果顯示，這3種藥物對褶皺臂尾輪蟲的毒性作用均隨濃度的升高而增強。隨著多年來的不斷探索，對國際上統一的輪蟲急性毒性實驗標準化方法的應用日趨規范和成熟。美國試驗材料學會(ASTM)將輪蟲作為海水監測生物列入國家標準，并且已形成了一套完善的參考標準及規范的操作流程[36]。據此，測試條件的持續時間和測試種的年齡均可達到標準化。

表1 輪蟲在生態毒理學實驗研究中的優勢Table 1 Advantages of rotifers in experimental studies

然而，實際環境中存在的復合污染作用機理復雜，影響因素較多，越來越多的研究希望通過設置不同毒物配比方式，評價不同污染物對輪蟲的聯合毒性效應，尋找其作用規律，以期為聯合毒性評價研究積累理論數據。2015年，沙婧婧等[37]以多溴聯苯醚中的BDE-47和BDE-209作為脅迫因子，以褶皺臂尾輪蟲為受試生物，研究其單一及聯合急性毒性效應。二者聯合作用時，分別采用濃度1:1和毒性1:1進行試驗，應用水生毒理聯合效應Marking相加指數法評價二者對輪蟲的聯合毒性，2種試驗配比方式得到的結果類似，96 h內隨著暴露時間的增加，BDE-47和BDE-209對其聯合毒性作用從協同作用轉變為輕微的拮抗作用；2016年，Zhang等[38]為探究重金屬復合污染對輪蟲的毒性影響，以萼花臂尾輪蟲為受試動物，選擇Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬，采用相加指數法開展了其24 h 聯合急性毒性作用的評價研究。目前，國內外專家學者們已逐漸重視并積極開展對輪蟲聯合毒性作用方面的研究。對于致毒機理不盡相同的混合污染物而言，在評價其聯合毒性效應時，都需進行具體的實驗研究后方可定論，不能簡單由單一急性毒性相加來判斷其毒性。聯合急性毒性實驗結果不僅豐富了輪蟲生態毒理學研究的基礎資料，同時也為開展評價復合污染的生態風險提供理論數據和科學參考。急性毒性實驗中，類似LC50的實驗終點還有LT50，為半數致死時間，即在給定毒物濃度的條件下殺死半數測試物種數量所需要的時間[39]。但如果污水中的有毒物質濃度太低，輪蟲不能在特定的時間內達到50%的死亡率。此種情況下，就會進一步采用慢性毒性實驗方法。

2.2 慢性毒性實驗

慢性毒性是指以低劑量外來化合物長期給予實驗動物接觸，觀察其對實驗動物所產生的毒性效應。慢性毒性試驗的目的是確定外來化合物的毒性下限，即長期接觸該化合物可以引起機體危害的閾劑量和無作用劑量，了解其毒作用特點、靶器官和毒性機制，且觀察受試生物是否具有毒性作用的可逆性[40-42]。輪蟲的慢性毒性實驗在個體水平、基因表達、生理生化、種群和群落水平也有一系列的指標。個體水平的反應，包括復雜的生理(食物選擇、消費、同化等)和行為(游泳速度改變、麻木、垂直遷移等)的相互作用。基因毒性方面，毒物進入輪蟲體內后，隨著暴露時間的延長，會引起輪蟲遺傳物質結構和功能的改變，從而對相關基因的表達產生影響[9]。生理生化方面，變化較為顯著的酶活性測試結果往往可從毒物對褶皺臂尾輪蟲的亞急性、慢性實驗中獲得[43]。輪蟲在毒物脅迫下的大多數生命表參數和種群統計學參數呈現出的變化，是對有毒物質產生作用的重要響應。種群增長率和最大種群密度是毒物脅迫作用下的2個顯著的生物指標[11, 44]。在絕大多數情況下，有毒物質能夠降低測試物種的最大種群密度。輪蟲的最大種群密度和種群增長率在實驗室條件下常用于慢性毒性試驗的結果衡量。例如，銅對褶皺臂尾輪蟲繁殖的抑制在出現死亡個體之前就已經顯現[1]。Snell和Hicks[45]應用褶皺臂尾輪蟲作為受試生物，進行慢性毒性實驗，研究比較聚苯乙烯納米粒子在自然海水和人工海水中的生態毒性，研究表明，毒性效應與顆粒大小有關，較大的顆粒(≥100 nm)會誘導輪蟲在胃腸中積累顆粒直到排泄，而較小的顆粒(50 nm)則可能由細胞攝入，可從輪蟲母體轉移到卵子，致使其生育率和攝食率的下降，從而導致了最大種群密度和種群增長率的降低。同樣地，Jeong等[6]通過慢性毒性實驗，也檢測到了輪蟲暴露在含納米顆粒等微塑料的水體中，其體內活性氧產生和抗氧化劑反應會受到顯著影響。目前，利用輪蟲評價環境激素效應已應為學術界普遍關注的熱點問題。我國有學者以淡水水體中普遍存在的萼花臂尾輪蟲為受試動物，研究了4種環境激素，包括雙酚A(bisphenolA)、阿特拉津(atrazine)、西維因(carbaryl)和久效磷(monocrotophos)對萼花臂尾輪蟲的生活史、無性生殖和有性生殖的影響[46]。眾多學者們之所以選擇輪蟲作為慢性毒性實驗研究的模式生物，主要是由于其本身的研究優勢和在水生態系統種群動態中起重要作用，以及在生態毒理學中具有標準化和可靠的實驗方法。

為能在較短的時間內經濟而靈敏地檢測出毒物對輪蟲的生殖毒性，1992年，Snell等[17]提出輪蟲短期慢性毒性實驗方法，在體積為12 mL的輪蟲培養液中(內含食物)接種6個0～2 h內的輪蟲幼體，于25 ℃下搖動培養48 h，然后計數培養液中的輪蟲，以種群增長率作為實驗終點。1994年，Janssen等[47]在1 mL 的輪蟲培養液中接種5只輪蟲幼體，于25 ℃下培養72 h。發現以此得到的種群增長率比2 d種群增長實驗所得到的更接近最大值。據此，2002年，Radix 等[48]應用該方法研究了環境雌激素壬基酚(nonylphenol)等對萼花臂尾輪蟲生殖的影響；2004年，Xi和Feng[49]也以此方法研究了除草劑草甘膦(glyphosate)和甲基托布津(thiophanate-methyl)對萼花臂尾輪蟲有性生殖和無性生殖的影響。Preston和Snell[50]提出與以上的靜態研究方法相似的4 d輪蟲休眠卵產量實驗方法，在12 mL輪蟲培養液中接種6只輪蟲幼體，靜態培養96 h后計數其中輪蟲休眠卵總數，以輪蟲的休眠卵產量作為實驗終點。這些短期慢性毒性實驗方法在短時間內檢測出毒物的毒性，能為進一步探討毒物影響輪蟲生殖的機制提供參考數據。

2.3 對輪蟲行為的影響

用行為學分析評估污染物的生物毒性作用有著獨特的優勢，因為行為反應迅速[51-53]。例如測定魚的行為已經在許多檢測項目中成為可接受的方法[54]。總體來說，在輪蟲的生態毒理學研究中僅少數的研究使用其行為特征作為實驗指標。然而，由于其行為的變化是高度一致的，因此，使用的行為測試標準也非常適用于急性毒性實驗。Janssen等[55]在淡水輪蟲萼花臂尾輪蟲對于特定毒物的實驗中，發現輪蟲的游泳速度、路徑、曲折度、活動周期與毒性物質銅、五氯苯酚(PCP)、3，4-二氯苯胺(DCA)和林丹存在一定的劑量-效應關系，即隨著有毒物質濃度的增加，游泳行為通常會受到抑制。Ramírez-Pérez等[56]研究了汞對輪蟲游泳行為的影響。Snell和Joaquim-Justo[57]指出，當接觸到有毒物質后，輪蟲通常降低游泳速度，最終下沉。而有些化學物質則只是增加了輪蟲游泳的曲折度[58-59]。以上現象對理解一個潛在的有毒物質可以影響和干擾個體乃至整個生態系統功能尤其重要。用行為測試獲得的2 h-EC50與用同種測試物種從傳統的急性毒理測試中獲得的24 h-LC50是一樣的數量級。相對于獲得半致死濃度(LC50)，輪蟲的行為(如游泳速度)變化可能在更短的實驗時間內即可得到。研究表明，輪蟲游泳行為特性的變化可以被視為敏感而快速的檢測毒物脅迫作用的指標。此外，回避行為經常發生水平低于公布的基于許多水質標準的半致死濃度(LC50)[57]。回避可以改變輪蟲的生存和繁衍，導致輪蟲豐度的降低和將能量轉移到更高的營養級。

低濃度或無毒的化學物質，包括低濃度的重金屬和農藥，已被證明能夠擾亂有機體化學信息的傳輸[38]。擾亂化學信息系統所需的濃度通常較低[60]。2種類型的輪蟲行為反應通常被選用于檢測污染物的毒性效應：游泳活動(即游泳的速度和曲折度)[61]和攝食[62]。對毒物最敏感的階段是有性生殖階段[50]。然而，通過對物種之間的比較研究發現，沒有任何一個單一物種能夠對所有化合物都具有最高敏感度[63]。

傳統的生態毒理學研究通常以給定的暴露時間來描述劑量-效應關系而忽略暴露過程和之后潛在的毒性影響。Chen等[64]在農藥樂果的毒性作用下對萼花臂尾輪蟲進行攝食行為評估，不僅在暴露時間內，也在暴露后的時段內評估。當輪蟲暴露于0.2 mg·L-1和1.0 mg·L-1的農藥時，隨著暴露時間的延長，能夠明顯觀察到3階段的階梯式脅迫作用，即輪蟲的攝食行為歷經了“應激興奮(stimulation)”、“適應與調整(acclimation)”以及“毒性作用”(toxic effects)3個階段。而高濃度組1.8 mg·L-1的樂果對輪蟲在整個作用過程中只造成了一步的“毒性作用”，沒有發現階段變化趨勢，可以很明顯地觀察到樂果對輪蟲攝食行為的抑制作用，推測可能是該濃度已經超過了輪蟲的忍耐閾值，使得身體機能受到了損害，無法產生應激興奮或適應。此外，盡管輪蟲的攝食行為在暴露結束后有一定的恢復，但在暴露結束后8 h攝食速率甚至會受到更大抑制。這種暴露后的潛在抑制效應與暴露濃度和時間有關。研究表明，農藥樂果對輪蟲攝食行為的影響具有高度的過程依賴性，可在暴露過程中引起逐步的脅迫作用，在暴露后造成潛在的毒性。抗癌藥物作為一種新興的環境污染物受到越來越多的關注。以類似的研究方法，2017年，學者們研究了抗癌藥物伊馬替尼(imatinib)對萼花臂尾輪蟲攝食行為的影響[65]。此研究也充分考慮到了藥物暴露之后和再暴露的影響。通過提高伊馬替尼的濃度來評估輪蟲的攝食行為。盡管過濾和攝食速率在暴露結束后有一定程度的恢復，但是顯著的攝食抑制效應仍舊持續存在。在再次暴露過程中，攝食行為受到的抑制作用低于第一次暴露，推測這說明輪蟲可能對同一種毒素產生了一定的耐受性。對輪蟲體內的乙酰膽堿酯酶(AchE)的活性和活性氧(ROS)水平也進行了檢測。伊馬替尼在暴露過程中和再暴露時抑制了AchE活性，而在再暴露過程中ROS水平顯著提升。上述研究提供了新的綜合評價毒物潛在環境風險的方法。

3 環境污染物脅迫對輪蟲的毒性影響(Toxicity of environmental pollutants to rotifers)

3.1 重金屬

作為水體中常見的污染物之一，重金屬離子具有在水體中難降解、存留時間長等特性，不僅能直接危害水生生物，且能通過食物鏈的富集作用對更高營養級的消費者構成威脅，最終危害人類健康，對生態系統造成嚴重的損害[66]。因此，對水生生物進行重金屬毒性研究有著十分重要的意義。早在20世紀70年代初，學者們就開始采用輪蟲作為受試生物來評價重金屬對水體的污染[67-68]。之后，相關研究呈現猛增之勢。Builkema[69]首次嘗試應用輪蟲作為受試生物評價重金屬離子毒性，獲得理想效果。痕量金屬可以維持生物體內重要酶代謝功能的正常發揮、體內生物大分子的結構和功能、參與生物體內的信號傳導等，是正常代謝所必需的；但是當其存在過多時，就會對生物體構成危害，如誘導輪蟲體內產生過量的活性氧，構成氧化脅迫(oxidative stress)，最終導致細胞的異常凋亡或壞死。而那些非必需重金屬如錫、鉛、銀等，由于基本上不具有生物功能，當其痕量存在時，即可對輪蟲產生毒害作用[70]。不同重金屬對同一種輪蟲的毒性存在很大差異。銅等5種金屬對無甲腔輪蟲(Lecaneinermis)的毒性大小依次是銅>鋁>鐵>鋅>錫>錳[71]。而不同種類的輪蟲對同一種重金屬的抵抗力也有所不同。Arias-Almeida和Rico-Martínez[72]發現，相對于臂尾屬和腔輪屬的輪蟲而言，大肚須足輪蟲(Euchlanisdilatata)對鎘、鉛和汞的毒性都更加敏感。此外，重金屬對輪蟲的慢性毒性隨著重金屬濃度的升高而愈發顯著。相關研究顯示，Cd2+和Cu2+隨著濃度的升高均對萼花臂尾輪蟲的存活率、繁殖率、凈生殖率和內稟增長率有更加顯著的抑制作用，而混交百分率和休眠卵數量也明顯增加[66]。Sarma等[73]也發現輪蟲的種群數量會隨著水體中Cu2+和Cd2+的濃度增大而顯著減少。重金屬還能夠影響輪蟲體內抗逆蛋白等的表達。分別暴露于一定濃度的Cu2+和Cd2+，經過24 h后，輪蟲(B.koreanus)熱休克蛋白(sp90α-1和sp70)mRNA水平均顯著上調[74]。目前的研究多集中于單一重金屬對輪蟲的毒性影響，重金屬復合污染對輪蟲的毒性影響，特別是慢性毒性效應研究方面國內外報道相對較少[75-77]，因此，這方面的研究還有待加強。另外，水體中重金屬多是以低劑量狀態存在的，但長期低劑量重金屬暴露對輪蟲的毒性影響一直沒有引起足夠的重視，只在較少的一些研究中被提及。如Sarma等[78]研究發現，當輪蟲(L.quadridentata)暴露于一系列Cu2+濃度(0.31～5 μg·L-1)中，輪蟲種群增長與銅濃度之間呈現一種雙相劑量-反應曲線，即低濃度刺激和高濃度抑制。相似的作用結果也在萼花臂尾輪蟲暴露在低濃度Zn2+的實驗研究中發現[79]。近年來，污染物的低劑量興奮效應(Hormesis)已成為生態毒理學研究的熱點，這種現象在低劑量重金屬對輪蟲的毒性作用中是否普遍存在亟需加強研究和證明。

3.2 紫外線(UV)輻射

臭氧層能夠吸收日光中大部分的紫外線B波段(UV-B)，臭氧層減薄會使照射到地表的UV-B輻射增多。UV-B(280～320 nm)輻射增強能夠引起一系列全球性變化和對生物產生生態學和生理學影響。Preston等[80]首先研究了UV-B輻射對毒物效應的影響，探究UV-B輻射是否能夠提高萼花臂尾輪蟲對五氯苯酚(PCP)或汞急性毒性的敏感性。研究表明，在一定持續時間的UV-B輻射和一定濃度的毒物作用下，UV-B輻射使得PCP和汞對B.calyciflorus的毒性提升了高達5倍，還觀察到LC50下降幅度達60%，且使B.calyciflorus的繁殖能力受到抑制。馮蕾等[81]研究發現，UV-B輻射對褶皺臂尾輪蟲和壺狀臂尾輪蟲(Brachionusurceus)2種輪蟲都有嚴重的傷害作用，且當輻射強度達一定強度閾值會對其產生急性致死作用。UV-B輻射還會對輪蟲的種群數量、雌體抱卵率和種群增殖率都有顯著影響。高劑量UV-B輻射對輪蟲的種群數量和雌體抱卵率有顯著的抑制作用，甚至可導致整個種群的滅絕[82]。此外，UV-B輻射增強對褶皺臂尾輪蟲的攝食也有顯著的抑制作用，隨著UV-B輻射劑量的增大，輪蟲對多種餌料單胞藻的濾水率和攝食率都表現出顯著下降的趨勢[83]。陳芝丹等[84]采用急性致死、單個體和群體培養實驗，研究了紫外線照射對褶皺臂尾輪蟲運動、存活分布與繁殖的影響，發現隨著照射時間的增長，輪蟲的運動能力下降并產生急性致死效應，死亡率與照射時間關系符合Sigmoid模型。紫外線照射下，輪蟲的生存數據符合Weibull分布，壽命、生殖期、生殖期的平均繁殖率均顯著下降，種群增長也呈下降趨勢。群體培養與單個體培養結果相似，卵密度、幼體密度和種群增長率均隨照射時間的延長而顯著下降。近年來，學者們運用紫外線輻射(UV)對褶皺臂尾輪蟲進行誘變處理，隨著UV輻射劑量的增加，輪蟲的孵化率、掛卵率呈下降趨勢，個體發育大小出現顯著變化。目前推測有以下原因：一是UV輻射改變了輪蟲的基因型；二是UV輻射的傷害作用使部分輪蟲的活動能力下降，從而使其攝食量減少，用于生殖的營養減少，表現為產出較小的卵，孵化出較小的輪蟲個體[85]。

3.3 持久性有機污染物(POPs)

持久性有機污染物(persistent organic pollutants，POPs)是指長期存在于環境中，具有高生物蓄積性、高致癌和難降解等特性的有機污染物，能夠在食物鏈中逐級放大，危害環境和人類健康。持久性有機污染物鄰苯二甲酸酯(phthalate acid esters，PAEs)是世界上廣泛使用的人工合成有機物，主要用作塑料增塑劑。目前PAEs引起的環境污染已受到全球性的關注。美國國家環保局(USEPA)將鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)等6種PAEs列為優先控制的有毒污染物[86]。趙蘭蘭等[87]運用輪蟲特有的3 d種群增長和4 d休眠卵產量實驗方法研究發現，一定濃度的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)和鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)均能夠顯著影響萼花臂尾輪蟲的種群增長、混交雌體的產生和休眠卵產量。Zhang等[88]研究了全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)對萼花臂尾輪蟲的毒性效應，二者是工業生產中常用的添加劑，也是水體中廣泛存在的持久性有機污染物全氟化合物(perfluorochemicals，PFCs)。PFCs是一種新型的持久性有機污染物，近幾年已成為國內外生態毒理學領域研究的熱點。雖然PFCs在自然水體中的濃度很低，但是，通過食物鏈的傳遞和放大，仍然會對高等動物包括人類造成極大的危害[88]。通過28 d的種群增長實驗得到PFOS和PFOA能降低輪蟲種群密度和提高混交雌體百分率，且能夠導致輪蟲產體積更小的卵，這說明二者所造成的毒性風險可以由母體傳給后代，也證明了二者對輪蟲在個體和種群水平上均有不利影響。全氟羧酸(perfluorinated carboxylic acids，PFCAs)也是全氟化合物(PFCs)中的一類典型代表，多種PFCs可以在環境中最終轉化為PFCAs類物質及其鹽類。2014年，Wang等[89]研究了全氟羧酸對萼花臂尾輪蟲的急性、慢性毒性效應，觀察了對其生長發育的影響，實驗得到，PFCAs(二碳～六碳)中的三氟乙酸(TFA)、五氟丙酸(PFPrA)、七氟丁酸(PFBA)、九氟戊酸(PFPeA)和十一氟己酸(PFHxA)對萼花臂尾輪蟲的24-h LC50分別為70、80、110、130和140 mg·L-1。PFCAs對輪蟲的急性毒性隨著碳鏈長度的增加而降低。還發現PFCAs能夠顯著降低萼花臂尾輪蟲的種群增長率，提高混交率、體型和卵的大小。多溴聯苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)也是一類新型的持久性有機污染物，常作為阻燃劑被廣泛應用于塑料、紡織品、建筑材料以及家用電器等領域。大量PBDEs通過各種途徑最終進入海洋，使海洋環境中的PBDEs濃度急劇上升，對海洋生物的影響也日趨加大。因此，近年來世界各國政府及學者對PBDEs污染方面的關注日益增多[90]。2015年，Sha等[90-91]針對PBDEs的毒性效應展開研究，選擇在海洋環境和海洋生物體內廣泛存在的低溴代的BDE-47和高溴代的BDE-209作為脅迫因子，以褶皺臂尾輪蟲作為受試生物，研究了2種PBDEs對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性、個體形態、運動行為、種群增長、抗氧化酶活力、脂質過氧化及DNA損傷的影響，系統研究BDE-47和BDE-209脅迫對于輪蟲個體及種群的影響，試圖找出響應脅迫的規律性，分析輪蟲抗氧化防御系統(antioxidant system)對2種PBDEs亞致死脅迫的響應，并從分子水平上分析了PBDEs對輪蟲DNA的損傷，對可能的毒性作用機理進行了初步探討，以期從種群、個體、生理生化、分子等不同生物組織層次和多個方面入手，評估各指標是否可以作為PBDEs毒性評估的有效途徑和監測手段。Wang等[92]研究了BDE-47脅迫對褶皺臂尾輪蟲的生殖毒性效應并基于抗氧化防御系統的機理進行了初步探討，BDE-47對輪蟲脅迫24 h之后，利用透射電鏡(TEM)觀察卵巢組織，結果顯示，BDE-47脅迫后，輪蟲的卵巢組織形態結構受到明顯的損傷，表現為卵黃腺形態皺縮，核結構畸形，卵巢組織內部脂質小滴數量明顯減少。卵黃腺結構被破壞，導致雌體輪蟲生殖能力的下降，進而體現在種群水平上；在生理生化水平上，基于ROS理論的氧化應激作用機制的研究發現，BDE-47脅迫會導致褶皺臂尾輪蟲體內ROS水平的升高進而引發氧化脅迫毒性效應，氧化脅迫干擾了輪蟲機體的解毒作用以及與谷胱甘肽代謝相關的抗氧化酶，包括谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase，GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)的活性和還原型谷胱甘肽(gultathione-SH，GSH)的含量；Zhang等[93]針對輪蟲體內氧化應激機制對BDE-47和BDE-209誘導褶皺臂尾輪蟲生殖與發育毒性效應的作用機制進行了探討研究，發現這2種PBDEs均能誘導褶皺臂尾輪蟲卵巢細胞內ROS水平的上升從而產生氧化脅迫，且與BDE-209相比，BDE-47能引發更嚴重的氧化脅迫。研究表明，當ROS水平達到產生氧化脅迫的水平時，便會激活抗氧化系統中抗氧化酶sod和cat基因的表達以及影響Ca2+平衡和cam基因的表達水平，以期通過基于Ca2+信號通路的氧化應激作用機制的調控以消除或減弱BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲造成的氧化脅迫。

3.4 農藥

除了以上3種脅迫條件，研究較多的還有農藥，各種種類的農藥也可對輪蟲個體及種群造成不同程度的影響。現在被用于農作物生產中的絕大部分農藥都是有機農藥，其中，市場上流行的主要有：有機氯農藥、有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥[94-95]。有機氯農藥具有穩定的化學性質，難以被化學降解及生物降解，對生物具有生殖毒性、內分泌干擾毒性、神經系統及免疫系統抑制毒性等，能夠對生態環境及人體健康構成嚴重威脅[94]。儲昭霞[96]應用輪蟲生態毒理學中的短期慢性毒性實驗方法——72 h種群增長實驗和96 h休眠卵產量實驗，研究了DDT、三氯殺螨醇、硫丹和林丹等4種具雌激素活性的有機氯農藥對萼花臂尾輪蟲無性生殖和有性生殖的影響，結果表明，這4種有機氯農藥能夠顯著影響輪蟲的種群增長和混交雌體的產生及受精作用。對輪蟲混交雌體產生的抑制作用很可能是環境雌激素效應的表現，研究指出以輪蟲的生殖來評價污染物的雌激素活性是一種簡捷、經濟又靈敏的方法。有機磷農藥的神經系統的生物毒性作用機理為抑制有機體乙酰膽堿酯酶的活性，從而引起乙酰膽堿代謝紊亂。其毒性作用主要體現在對生物個體生理狀況與繁殖的影響，可抑制水生生物的生長、攝食和呼吸過程。此外，有機磷農藥可對生殖過程產生影響，抑制繁殖，減少后代數量，并對胚胎有致畸作用，同時能夠導致生物體內分泌功能失調，影響性腺發育和激素分泌[94-95]。謝欽銘等[97]研究發現，褶皺臂尾輪蟲的孵化率隨著2種有機磷農藥敵百蟲和久效磷濃度的增加而降低，孵化時間也隨之延長，2種有機磷農藥對褶皺臂尾輪蟲的48 h半致死濃度(LC50)分別是2.8767 mg·L-1和0.0534 mg·L-1。陸正和等[98]研究得到，有機磷農藥殺螟硫磷對輪蟲24 h急性毒性半致死濃度為9.57 mg·L-1；慢性毒性實驗中，隨著殺螟硫磷濃度升高，輪蟲幼體期延長，生殖期縮短，壽命縮短，生殖量下降，種群增長隨濃度增加而減緩；其休眠卵數量和孵化率明顯下降。呂林蘭等[99]研究了有機磷農藥樂果對萼花臂尾輪蟲生殖的影響，結果表明，萼花臂尾輪蟲凈生殖率是檢測樂果毒性的最敏感指標。氨基甲酸酯類農藥是一種高效、低毒、低殘留的農藥，它的作用機理和有機磷農藥相似，都是抑制昆蟲乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的活性，影響昆蟲正常的神經傳導而將其毒害。同時，氨基甲酸酯類農藥也可抑制水生生物的生理過程和繁殖[94]。劉劍鋒[100]采用生態毒理學方法，研究了特定環境下2種氨基甲酸酯類農藥殺蟲劑西維因(carbaryl)和異丙威(isoprocarb)對萼花臂尾輪蟲生長和繁殖的影響，通過單個體生命表實驗方法，發現一定濃度的西維因和異丙威均能夠顯著降低(縮短)輪蟲的平均壽命、世代時間、凈生殖率和內稟增長率；應用群體培養法，得到二者對輪蟲的攜卵雌體數/非攜卵雌體數、受精率、休眠卵產量、種群增長率、混交率以及休眠卵孵化率均產生顯著影響，其中，休眠卵產量是最為敏感的指標。可見，輪蟲的生殖參數和種群參數是檢測農藥生態毒性的重要指標，積累的毒性數據資料可以為利用輪蟲評價農藥的潛在風險提供依據。

4 展望(Prospect)

輪蟲在生態毒理學研究中具有非常高的應用價值，是水生生態毒理學新興領域大有前景的受試生物之一，已被國際上公認為水生生態毒理學實驗研究所采用的無脊椎動物中的代表生物，適用于海洋或淡水環境。預計未來輪蟲將在生態毒理學和環境基因組學中發揮越來越重要的作用，主要有以下幾個原因：首先，關于輪蟲類群的遺傳信息積累，特別是關于它的基因組和轉錄特征方面的研究[4]，將大大有助于未來環境基因組學的發展。輪蟲在環境溫和時均進行孤雌生殖，可維持自身基因型的穩定性，因而當外源基因嵌入輪蟲基因組后，便會穩定地整合于基因組中，連續傳代保持著高度一致的基因型，外源基因便可傳代，持續表達特定的生物活性產物。2013年，Nature上發布了有關蛭形目輪蟲基因組的研究報道[101]，提出蛭形輪蟲可選擇性整合其他物種如細菌、真菌及動植物體內的DNA片段，這將益于其生存發展的某些基因合并到自身基因組內為自身及后代所用。這與生物界對外源DNA片段極具抵御性的其他多細胞動物相比，輪蟲是整合外來基因、表達外源蛋白的極佳模式生物體；其次，由于公眾和監管部門對于水環境污染問題具有持續較高的關注，需要一種易培養的無脊椎動物類群，而輪蟲易培養且不污染水質，對外界水環境介質變化具有敏感性，這對于水污染風險評估和生態毒理學機理的研究十分必要；第三，輪蟲分布廣泛，取材簡便，可以建立全球多個實驗室之間輪蟲生態毒理學的合作，這將有助于進行更多的綜合性研究。例如，由Denekamp等[4]設計的EST(expressed sequence tags)工程所貢獻的B.plicatilis的基因轉錄組資源可用于未來全球范圍的基因表達實驗。與其他水生無脊椎動物相比，輪蟲具有龐大的數據庫和標準化的方法，這有利于選擇輪蟲作為代表性的模式物種。總之，輪蟲的生物學特性，使之成為水生動物的模式生物，其體積小、繁殖力高、生命周期短、分布廣、易培養、具有獨特的生活史、在生態及分類學上具有代表性，這些都大大增強了輪蟲在水生生態毒理學和毒理基因組學的應用潛力[1]。此外，輪蟲在藥品污染水環境的風險評估方面也有重要用途，因為其對某些藥品成分的敏感性高于其他浮游生物[57]。輪蟲在基因表達分析方面具有很大的優勢。

目前，各國專家學者對于輪蟲開展了一系列的生態毒理學實驗，取得了顯著成效，但有些方面仍需要更多的研究。對于未來開展環境污染物對輪蟲的生態毒理效應研究提出以下展望：(1)加強生態毒性效應相關的基因分析和環境基因組研究。輪蟲應激基因表達的定量分析可用來評估毒理效應，從而研究毒性作用的分子機制，這種深層次的研究在未來更有發展前景。例如，2017年，Kim等[102]從海洋輪蟲B.plicatilis轉錄組中發現了28個細胞色素P450基因且分析了它們的表達，試圖闡明輪蟲B.plicatilis對毒物的分子防御機制。目前，萼花臂尾輪蟲具有針對不同毒物測試所獲得的信息量最大的數據庫。下一步更多的研究應該用來比較輪蟲種間(即遺傳或地理種群之間)和種內對環境污染物敏感性的差異。這種差異相差的幅度需要與實驗室測試中其他條件的差異性和培養的不穩定性所造成的隨機變化相比較[103-104]。(2)研究需要更多地在蛋白質組學和生理生化水平上了解輪蟲機體功能的應激機制。隨著生物技術的發展，污染物對蛋白質及酶等生物大分子的毒性作用機理逐漸被關注。針對不同的研究目的選取不同測試指標，進而在不同水平上進行毒性評估和機理研究。近年來發展起來的許多生物標志物，如氧化應激酶、基因毒性、溶酶體改變、免疫活性以及膽堿酯酶活性等常被用于輪蟲生態毒理學研究[105-108]，能夠提供更完整、更可靠的信息，且多指標全面表征逐步代替單一指標測試，以更全面準確地評估污染物對輪蟲的毒性影響，然而對于輪蟲針對不同特定毒物的特異性生物標志物的篩選研究還有待進一步完善。(3)需要不斷統一協調和規范輪蟲的標準測試方法，使得數據信息之間便于比較[29]。目前，在輪蟲行為測試方面仍存在爭議[57]，例如在亞致死劑量水平，輪蟲的一些行為變化是否在亞致死劑量水平上可以作為檢測毒物毒性的依據，其是否能夠主動回避毒物，如何在實驗中避免這種影響所造成的差異，這些問題仍需要進一步研究。(4)重視污染物對輪蟲毒性作用的過程依賴性影響。污染物對輪蟲暴露、暴露后、再暴露的研究是一種新的綜合評價毒物毒性效應潛在風險的方法。傳統的毒理學研究通常以給定的暴露時間來描述劑量-效應關系而忽略暴露之后的潛在毒性影響。近幾年來的一些研究也表明了毒物對輪蟲的影響具有高度的過程依賴性，在暴露過程中引起逐步的脅迫，在暴露后繼續存在潛在的脅迫[64-65]。因此，未來針對輪蟲的生態毒理學研究應充分考慮到毒物暴露之后和再暴露的影響。