叢枝菌根真菌砷酸鹽還原酶基因RiarsC的克隆和功能分析

李景龍，孫玉青，陳保冬，李濤，胡亞軍，張莘,*

1. 中國科學院生態環境研究中心 城市與區域生態國家重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學，北京 100049

砷(arsenic，As)是一種毒性極強的環境污染物和一類致癌物。自然因素及人類活動造成的土壤和水體砷污染已經成為亟待解決的全球性的環境問題[1]。亞洲是受砷污染威脅最嚴重的地區，越南、印度、孟加拉等國以及我國的湖南、貴州、廣東、內蒙古、山西以及臺灣等地均受到不同程度的砷污染危害[2-3]。環境中的砷對生物體從表觀、生理到遺傳方面都有嚴重的毒害作用，更可以通過飲用水和食物鏈危及人體健康[4]。

自然土壤和水體中的砷主要以無機五價砷As(V)和無機三價砷As(III) 2種氧化態存在[5]。As(V)主要通過磷轉運蛋白進入生物體內，而As(III)通過水通道蛋白被生物吸收[6]。砷吸收進入生物細胞后，會發生一系列砷還原和甲基化的轉化過程。As(V)首先在砷酸鹽還原酶的作用下被還原成As(III)，生成的As(III)可以被金屬硫蛋白、植物絡合素等結合固持在液泡中降低其移動性，或者通過特異性的膜轉運蛋白將As(III)排出體外，抑或在砷甲基轉移酶的作用下將As(III)轉化為低毒的甲基砷最后以揮發態排出體外，從而達到砷解毒的目的[7]。因此，將As(V)還原為As(III)是生物砷代謝及解毒過程中的關鍵環節。砷酸鹽還原酶基因在細菌、真菌以及植物中已有廣泛報道。希瓦氏菌Shewanellasp. strain ANA-3敲除砷酸鹽還原酶基因arrAB后則無法在含As(V)的環境中存活[8]；萊茵衣藻C.reinhardtii能夠利用其自身的砷酸鹽還原酶基因CrACR2.1和CrACR2.1將培養基中添加的As(V)還原為As(III)并外排到環境中[9]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是土壤中普遍存在的一類內生真菌，能夠與絕大多數陸生植物形成共生關系[10]。AMF在改善植物礦質營養狀況，促進植物生長，提高植物對干旱、重金屬等逆境脅迫的耐性等方面都發揮了重要作用[11-12]。研究表明，接種AMF能夠顯著降低植物體內的砷濃度。一方面，AMF通過改善植物磷營養狀況，促進植物生長，從而稀釋了植物體內過量的砷[13]；另一方面，AMF的侵染能夠使植物根系的高親和磷轉運蛋白的表達量下調，抑制植物對As(V)的吸收[14]。此外，Gonzalez-Chavez 等[15]發現，AMF可能同樣具有將體內的砷通過As(III)外排系統排出體外的能力。As(III)外排泵ArsAB由ATP酶GiArsA和As(III)透過酶GiArsB組成。環境中的As(V)通過根外菌絲上的高親和磷轉運蛋白GiPT進入真菌菌絲，隨后在菌絲內被還原為As(III)，然后在ArsAB的作用下排出體外。Li等[16]研究發現，接種AMF能夠顯著提高水稻根系As(III)/As(V)的比例；Zhang等[17]在接種AMF的紫花苜蓿體內檢測到了更高比例的As(III)，這些結果表明AMF很可能直接參與了As(V)的還原過程。在這一途徑中，已鑒定出As(V)轉運蛋白基因GiPT和As(III)外排泵ArsAB中的ATP酶基因GiArsA[15]。然而，作為AMF砷代謝的關鍵步驟，As(V)還原過程的分子機制還未見報道。

本研究從AMF異形根孢囊霉RhizophagusirregularisDAOM 197198中克隆得到了一個砷酸鹽還原酶基因RiarsC，并將該基因轉入arsC缺陷型大腸桿菌E.coli菌株中。通過對E.coli的砷抗性和砷形態分析，對該基因的功能進行了初步的驗證，從分子水平闡釋了AMF對As(V)的還原機理，更進一步揭示了AMF增強植物砷耐性的分子機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試菌株

AMF異形根孢囊霉RhizophagusirregularisDAOM 197198，由中國科學院生態環境研究中心土壤生態過程與生態重建研究組保藏。利用雙重無菌培養體系對R.irregularis進行培養[18]。二分室培養皿分為菌根室和菌絲室，在菌根室中加入30 mL固體M培養基，用0.4% (w/v) phytagel (Sigma-Aldrich，USA) 作為凝固劑；在培養基上接種轉發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes) Ri T-DNA質粒的胡蘿卜(Daucuscarota)毛狀根，并接種R.irregularisDAOM 197198無菌孢子；待毛狀根布滿菌根室后，在菌絲室加入15 mL液體M培養基；25 ℃黑暗培養8周直至R.irregularis菌絲布滿菌絲室，用于RNA的提取。

1.2 RNA提取

取0.05 g新鮮菌絲用TRIZOL試劑(Invitrogen，USA)提取總RNA。用紫外分光光度計(Nano drop 2000，USA)測定RNA的濃度和純度并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取2 μg RNA，用逆轉錄試劑盒PrimeScript?RT Reagent Kit(TAKARA，大連)合成cDNA，具體方法參照試劑說明書。

1.3 叢枝菌根真菌砷酸鹽還原酶基因RiarsC的克隆

根據GenBank上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)叢枝菌根真菌異形根孢囊霉R.irregularisDAOM 197198 基因組中預測的砷酸鹽還原酶基因(Genbank登錄號KI300620.1)設計全長引物RiarsC1F：5′-ATGTCATTTCGACTAAATATGG-3′和RiarsC1R：5′-TCATTCCTTTGTATATCCCAAC-3′。以cDNA為模板，利用高保真酶 KOD-plus(TOYOBO，Japan)進行 PCR 擴增，獲得基因全長，將該基因命名為RiarsC。PCR條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性15 s，53 ℃退火45 s，68 ℃延伸1 min 20 s，35個循環，72 ℃終延伸1 min。將擴增產物回收，連接pGEM-T Easy克隆載體(Promega，USA)后，轉入感受態細胞E.coliJM109(TAKARA，大連)，篩選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。從陽性菌株中提取質粒，利用引物RiarsC2F：5′-CGCGGATCCATGTCATTTCGACTAAATATGG-3′和RiarsC2R：5′-CCGGAATTCTCATTCCTTTGTATAT CC-3′進行PCR擴增為該基因加入酶切位點BamHI和EcoRI(下劃線所示)，PCR條件同上。擴增產物回收后，連接表達載體pET-28a+(Biofeng，上海)并轉入砷敏感型E.coliWC3110(DE3)(ΔarsC)中，該菌株敲除了E.coliR773質粒上的砷酸鹽還原酶基因arsC，對As(V)的還原能力大大降低[19]。將轉入RiarsC的菌株命名為WC3110+RiarsC；同時，將空載體pET-28a+轉入E.coliWC3110中作為陰性對照，將該菌株命名為WC3110+pET28a。將菌株WC3110+RiarsC，WC3110+pET28a，WC3110和野生型E.coliW3110這4種菌株轉入LB液體培養基中37 ℃、180 r·min-1震蕩培養。

1.4 RiarsC序列分析和系統發育樹構建

將測序成功的RiarsC擴增片段序列與已知的細菌、真菌砷酸鹽還原酶基因序列在NCBI上進行BLAST分析。利用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org)對RiArsC蛋白進行氨基酸序列推導及分子量預測。利用MEGA 7.0.14軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建氨基酸序列系統發育樹。

1.5 As(V)抗性分析

將上述4種菌株在LB培養基中培養8 h后，取1 mL菌懸液分別加入到100 mL新鮮的LB培養基中。LB培養基中加入0.3 mmol·L-1IPTG，50 mg·L-1卡那霉素(WC3110和W3110除外)以及2種濃度的Na3AsO4·12H2O(50 μmol·L-1and 100 μmol·L-1；分析純，國藥集團)，每種菌株處理重復3次。4種菌株于37 ℃，180 r·min-1避光震蕩培養，利用紫外-可見分光光度計(UV-1700，Shimadzu，Japan)每2 h測定一次菌懸液在600 nm處的吸光度(OD值)，共計測量7次，將吸光值繪制成細菌生長曲線。

1.6 砷形態分析

將上述4種菌株和只加As(V)的無菌空白對照(Control)共5個處理在LB培養基中培養8 h后，取1 mL菌懸液分別加入到100 mL新鮮的LB培養基中。LB培養基中加入0.3 mmol·L-1IPTG，50 mg·L-1卡那霉素(WC3110和W3110除外)以及20 μmol·L-1Na3AsO4·12H2O，每個處理重復3次。將所有處理于37 ℃、180 r·min-1避光震蕩培養12 h后，8 000 r·min-1離心10 min收集菌體和上清液。菌體-50 ℃冷凍干燥后稱重，加入5 mL 1% HNO3(優級純，國藥集團)在MARS 5微波消解萃取系統(CEM，USA)中消解。消解程序為：55 ℃維持10 min；75 ℃維持10 min；95 ℃維持30 min。消解液及上清液過0.45 μm濾膜后置于4 ℃保存。采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜儀聯用(HPLC-ICP-MS)(Agilent 7500，Agilent Inc.，U.S.A.)測定濾液中各形態砷的含量。不同砷形態的分離采用PRP-X100陰離子交換柱(Hamilton，U.S.A.；240 mm×4.1 mm)，并配有相同填料的保護柱(11.2 mm，12～20 mm)。流動相含有10 mmol·L-1(NH4)2HPO4和 10 mmol·L-1NH4NO3，pH=6.2。流動相:超純水體積比=70:30，流動相流速為1 mL·min-1。樣品中各砷形態根據標準物質中三價砷As(III)和一甲基砷MMA、二甲基砷DMA、五價砷As(V)的保留時間確定，用winfass積分軟件計算峰面積。

1.7 數據統計方法

利用SPSS 20.0軟件(SPSS，Inc.，U.S.A.)對細菌的生長曲線數據進行重復測量的單因素方差分析(Repeated measured ANOVA)計算4種菌株生長曲線的差異顯著性。

2 結果(Results)

2.1 AMF砷酸鹽還原酶基因RiarsC的克隆與序列分析

從異形根孢囊霉R.irregularisDAOM 197198 cDNA中克隆得到了一個砷酸鹽還原酶基因RiarsC。測序結果顯示完整的開放閱讀框(ORF)全長為438 bp，編碼145個氨基酸，估測的蛋白質分子量為16.69 kDa，等電點為8.50(Genbank登錄號ERZ96229.1)。系統發育樹分析顯示，在已知的砷酸鹽還原酶家族中，RiArsC與谷氧還蛋白-谷胱甘肽依賴的砷酸鹽還原酶Grx/GSH家族具有高度的同源性(圖1)。

圖1 基于鄰接法(Neighbor-Joining)構建的RiArsC蛋白與其他細菌、真菌砷酸鹽還原酶氨基酸序列系統進化樹注：物種名稱后顯示該蛋白的Genbank登錄號，黑色方框所示為RiArsC。Fig. 1 Phylogenetic tree of RiArsC and other arsenate reductases in bacteria and fungi based on the Neighbor-Joining Method using MEGA 7.0.14Note: The accession numbers are shown after the species names. RiArsC is labeled using a black square.

2.2 表達RiarsC基因的E. coli菌株的As(V)抗性分析

砷敏感型E.coli菌株WC3110與野生型菌株W3110相比，敲除了砷酸鹽還原酶基因arsC，As(V)還原能力大大降低。重復測量的單因素方差分析結果表明，在較低的As(V)添加水平下(50 μmol·L-1)，WC3110的OD值顯著低于W3110，對As(V)的抗性不及野生型菌株W3110(圖2a；P<0.05)；在高濃度的As(V)(100 μmol·L-1)處理下，W3110與WC3110相比的生長優勢更加明顯(圖2b；P<0.05)；在As(V)添加濃度為50 μmol·L-1時，表達RiarsC的菌株WC3110+RiarsC與表達空載體的菌株WC3110+pET28a相比對As(V)具有更強的抗性(圖2a；P<0.05)；當砷添加濃度升高至100 μmol·L-1時，雖然WC3110+RiarsC與WC3110+pET28a的生長均受到了明顯的抑制，但WC3110+RiarsC的生長優勢體現得更加明顯(圖2b；P<0.05)。

2.3 Escherichia coli菌株的砷形態分析

經12 h的培養，野生型E.coli菌株W3110將LB培養基中87.29%的As(V)還原為As(III)，而arsC缺陷型菌株WC3110只將培養基中16.33%的As(V)轉化為As(III)(圖3a，b)。表達RiarsC的菌株WC3110+RiarsC對培養基中As(V)的還原率為71.04%，比arsC缺陷型菌株WC3110對As(V)的還原能力提高了4.35倍，比表達空載體的菌株WC3110+pET28a還原效率提高了61.98%(圖3a，b)。

在E.coli菌體中，WC3110+RiarsC，WC3110+pET28a，WC3110和W3110這4種菌株As(III)占總砷的比例分別為50.24%，17.16%，12.22%和60.69%(圖3c，d)。其中，野生型E.coli菌株中As(III)的比例比arsC缺陷型菌株WC3110提高48.47%；表達RiarsC的菌株WC3110+RiarsC與表達空載體的菌株WC3110+pET28a相比，As(III)的比例提高了33.08%。此外，WC3110+RiarsC與W3110菌體中的總砷濃度要明顯低于WC3110+pET28a和WC3110(圖3c，d)。

3 討論(Discussion)

砷酸鹽還原酶在微生物和植物體的不同砷代謝途徑中均發揮著重要的作用。本文從AMF異形根孢囊霉R.irregularis中克隆得到了一個砷酸鹽還原酶基因RiarsC。利用異源表達的方法將其導入砷敏感型E.coli菌株WC3110中。結果表明，RiarsC基因的表達提高了E.coli對As(V)的抗性；同時，表達RiarsC的E.coli能夠將培養基及體內更多的As(V)還原為As(III)，顯著提高了E.coli對As(V)的還原效率。

圖2 不同Escherichia coli 菌株的As(V)抗性生長曲線注：圖a，b分別表示添加50 μmol·L-1 和100 μmol·L-1 As(V)時，表達RiarsC的E. coli菌株WC3110+RiarsC，表達空載體的E. coli菌株WC3110+pET28a，砷酸鹽還原酶基因arsC缺陷型E. coli菌株WC3110(ΔarsC)和 野生型E. coli菌株W3110的As(V)抗性生長曲線；均值±SE，n=3。Fig. 2 The growth curves of Escherichia coli strainsNote: Figure a and b respectively indicate at the As(V) concentrations of 50 μmol·L-1 and 100 μmol·L-1, the growth curves of E. coli bearing RiarsC (WC3110+RiarsC), vector plasmid pET28a (WC3110+pET28a), WC3110 (ΔarsC) and wild type (W3110); means±SE, n=3.

圖3 不同Escherichia coli菌株和培養基中的砷形態及濃度注：圖a，b分別表示表達RiarsC的E. coli菌株WC3110+RiarsC，表達空載體的E. coli菌株WC3110+pET28a，砷酸鹽還原酶基因arsC缺陷型E. coli菌株WC3110(ΔarsC)，野生型E. coli菌株W3110及As(V)無菌空白對照Control處理中液體LB培養基中的砷形態和濃度；圖c，d分別表示上述4種E. coli菌體中的砷形態和濃度；均值±SE, n=3。Fig. 3 The As species and concentration in Escherichia coli and LB mediumNote: Figure a and b indicate the As species and concentration in LB medium cultivating WC3110 bearing RiarsC (WC3110+RiarsC), vector plasmid pET28a (WC3110+pET28a), WC3110 (ΔarsC), wild type (W3110) and blank (Control), respectively. Figure c and d respectively indicate the As species and concentration in four different E. coli strains; means±SE, n=3.

生物的砷酸鹽還原酶主要包括3個家族(圖1)：最早發現的是Grx/GSH家族，它使用谷氧還蛋白(Grx)或谷胱甘肽(GSH)作為電子供體，由ars操縱子上的arsC基因編碼，產物為ArsC，主要存在于原核細胞中；第二家族的蛋白產物也叫ArsC，但使用硫氧化還原蛋白(Trx)作為電子供體，被稱為Trx家族，與Grx/GSH家族的基因序列和蛋白結構有所不同；第三家族被稱作ACR2家族，該家族也使用Grx/GSH作為電子供體，主要存在于真核生物中，如酵母、藻類和植物等[20]。本文從AMFR.irregularis中克隆獲得了一個砷酸鹽還原酶基因，命名為RiarsC。序列分析結果顯示，該基因編碼的蛋白序列與Grx/GSH家族的砷酸鹽還原酶具有高度的相似性。與通常的分類不同的是，RiArsC并不屬于真核生物的砷酸鹽還原酶ACR2家族，而與原核生物的砷酸鹽還原酶ArsC具有更近的親緣關系。目前為止，只有極少數真菌的砷酸鹽還原酶屬于此類，如假裸囊菌屬的P.destructans(GenBank: OAF59943.1)和外瓶霉屬的E.oligosperma(GenBank: KIW42989.1)等。AMF在將As(V)還原為As(III)的過程中是否利用Grx/GSH 作為還原劑，以及具體的調控機制還需要深入研究。

砷抗性分析結果表明，與野生型E.coli菌株W3110相比，arsC缺陷型菌株WC3110在含As(V)培養基中的生長受到明顯的抑制。而表達RiarsC基因的E.coli菌株在含有As(V)的培養基中的生長狀況與表達空載體的菌株相比具有更加明顯的優勢，甚至當As(V)濃度升高至100 μmol·L-1時仍然對As(V)具有一定的抗性。這說明RiarsC基因在一定程度上彌補了E.coli中arsC的功能缺失，增強了菌株WC3110對As(V)的抗性。

E.coli的砷代謝過程由R773質粒上arsRBC操縱子調控，細胞內的As(V)被ArsC還原后再在ArsR和ArsB的共同作用下排出體外[21]。為進一步探究RiarsC提高E.coli對As(V)的抗性機理，我們對E.coli菌體和培養基中的砷進行了形態分析。我們發現，與野生型菌株W3110相比，arsC缺陷型E.coli菌株WC3110對As(V)的還原能力大大減弱，體內積累了更多的砷無法通過As(III)轉運通道排出體外，對As(V)的抗性較弱。因此，LB培養基中以As(V)為主要的砷形態。當WC3110轉入RiarsC基因后，菌株體內及培養基中的As(III)濃度顯著升高，說明這時E.coli菌株重新獲得了將As(V)還原為As(III)的能力，體內積累的砷能夠以As(III)的形式排出體外。因此該菌株內的總砷濃度大大降低而培養基中的主要砷形態也由As(V)轉為As(III)。以上結果證明了RiarsC基因具備將As(V)轉為As(III)的能力。

本研究從AMF中克隆得到了一個砷酸鹽還原酶基因RiarsC，并通過異源表達的手段初步探討了該基因的體外功能。結果發現，RiarsC提高了砷敏感型E.coli的As(V)抗性，并且能夠將培養基中的As(V)還原為As(III)后排出體外。微生物的砷外排機制主要包括As(V)的吸收，As(V)的還原以及As(III)的跨膜運輸。已經有研究鑒定出了AMF砷外排過程中的As(V)吸收通道蛋白GiPT和As(III)跨膜運輸過程中的關鍵基因GiArsA[15]，為AMF的耐砷機制提供了有力的證據。在此基礎上，本研究進一步為AMF的砷代謝機理提供了新的分子證據。后續的研究應該在原位開展AMF的砷形態轉化和外排機理，明確這些功能基因在AMF砷代謝過程中的相互聯系，為AMF的耐砷機制提供更全面的證據。

致謝：感謝國家自然科學基金面上項目(41471219，21677164)對本研究的支持。感謝中國科學院城市與環境研究所朱永官教授對E.coli菌株W3110和WC3110的惠贈。