DEHP和MEHP對H295R細胞類固醇激素合成基因表達的影響

葉婷，董四君，王佳，楊丹，楊文佳，李燦,*

1. 貴陽學院生物與環境工程學院 貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲重點實驗室，貴陽 550005 2. 中國科學院城市環境研究所 中國科學院城市環境與健康重點實驗室，廈門 361021 3. 泰山醫學院公共衛生學院，泰安 271016

鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl)-phthalate, DEHP)作為增塑劑普遍用于聚氯乙烯(poly vinyl chloride, PVC)材料中，如地板、電纜和房屋裝飾材料等建筑材料，還普遍用于血袋、血管和透析儀等醫療器械[1]。DEHP與聚氯乙烯材料不是以化學鍵結合，而是以普通的分子間作用力結合，所以容易從塑料材料中釋放進入環境中[2]，然后通過食物鏈在生物體內富集，引起神經、免疫、肝臟、生殖等毒性作用[3-4]。人體通過食品攝入、呼吸空氣、飲用水、皮膚吸收及靜脈注射等多種途徑暴露于DEHP[5-7]，其中攝入被DEHP污染的食品是暴露DEHP的主要途徑，人體內超過90%的DEHP來自食品攝入[8]。DEHP進入機體后，一部分以原型直接被吸收，另一部分受胰腺酶和腸道內一些酶的作用，迅速由雙酯轉化為單酯，主要代謝產物是鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(mono-(2-ethylhexyl)phthalate, MEHP)[9]。很多哺乳動物研究顯示DEHP的代謝產物MEHP的毒性效應強于DEHP，并且DEHP產生的毒性效應主要是由其代謝產物引起的[10]。許多動物研究表明DEHP和MEHP影響了類固醇合成活性[3-4]，但對其機制缺乏系統的認識。目前大多數關于DHEP和MEHP的研究局限于體內研究，而且關于DEHP和MEHP對類固醇激素合成的影響，還沒有相關體外研究進行全面的評價。Harvey等[11]提出了H295R細胞系類固醇合成干擾實驗可作為評價化學物對類固醇激素生成過程干擾的策略，并指出H295R細胞系是一種有效的體外篩選環境類固醇激素干擾物的細胞模型。美國國家環境保護署也正在建立利用H295R細胞系檢測環境污染物對類固醇激素生成干擾效應的方法來研究環境中污染物的內分泌干擾效應[12]。相對基于組織評價類固醇激素干擾的方法，H295R細胞評價的優勢還在于它能評價環境中的污染物對細胞活力和細胞毒性的影響，這是一個重要的特征，以區別化學物是通過直接的細胞毒性作用還是間接的生成類固醇通路的影響產生效應，這點是體外培養的多細胞組織方法不能做到的。并且H295R細胞容易獲得、培養簡單并可穩定傳代，可有效代替動物和組織實驗方法，簡單且經濟。因此H295R細胞系成為體外篩選環境類固醇激素干擾物及研究其機制的最具潛力的工具，能同時從基因表達、酶活力和激素水平幾個層面進行檢測[13]。

本研究采用H295R細胞模型類固醇激素合成干擾試驗，從細胞活力、類固醇激素合成關鍵基因表達、關鍵調控因子和關鍵受體的基因表達等方面，對DEHP及其主要代謝產物MEHP的類固醇激素合成干擾效應進行分子機制層面的研究。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

人腎上腺皮質腺癌細胞H295R細胞系購自國家實驗細胞資源共享平臺。細胞培養：H295R細胞系常規培養于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中。細胞培養采用DMEM/F12(1∶1)培養基，培養基中需添加成分包括2.5% Nu-Serum I，15 mmol·L-1HEPES，0.00625 mg·mL-1insulin+0.00625 mg·mL-1transferrin+6.25 ng·mL-1selenium+1.25 mg·mL-1bovine serum albumin+0.00535 mg·mL-1linoleic acid。2～3 d更換一次培養液，待細胞單層生長至80%～95%后，用PBS溶液輕洗2次，加入適量0.05%胰酶-EDTA溶液消化2 min，800～1 000 r·min-1離心5 min后棄上清液，加入培養基重懸細胞，按照1∶3比例傳代。

1.2 儀器與試劑

儀器：CO2細胞恒溫培養箱(日本SANYO公司)；Spectra Max M5多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；HR40-IIA2超凈工作臺(中國Haier公司)；UNIVERSAL 320R臺式(常溫/低溫)離心機(德國Hettich Zentrifugen公司)；ND1000超微量紫外可見分光光度計(美國Gene Companey Limited公司)；Mastercycler?personal PCR儀(德國EPPENDORF公司)，Lightcycler 480實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；生物顯微鏡(上海長方光學儀器有限公司，中國)；Cascada I超純凈水系統(美國Cascada公司)；HS-840-U無菌工作臺(中國蘇州安泰空氣技術有限公司)；細胞培養瓶、培養板(丹麥NUNC公司)。

試劑：DEHP，優級純，購于美國Supelco公司，溶于二甲基亞砜(DMSO，優級純，美國Sigma-Aldrich公司)，濃度為1 g·mL-1，將母液用DMSO稀釋至0.001 g·mL-1備用；MEHP，優級純，購于美國AccuStandard公司。將MEHP用DMSO配成0.001 g·mL-1母液備用；DMEM/F12(1∶1)(美國，HyClone公司)；胎牛血清(美國，Life Technologies公司)；0.05%胰酶EDTA溶液(美國，Life Technologies公司)；Hepes(美國，Sigma公司)；Nu Serum I(美國，BD Biosciences公司)；MTT(美國，Sigma公司)；ITS+Premix A(美國，Life Technologies公司)；RNA提取試劑盒(美國，Omega生物技術公司)；反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM RT-PCR Kit，寶生物工程(大連)有限公司)；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.3 MTT實驗

MTT法檢測細胞活力的實驗原理是活細胞線粒體中存在的琥珀酸脫氫酶可以使黃色的MTT還原為不溶性的藍紫色結晶化合物甲瓚(formazan)沉積于細胞內，而死細胞中此酶消失，MTT不能被還原。在一定細胞數范圍內，甲瓚形成的量與活細胞數目成正比。二甲基亞砜(DMSO)溶解細胞中的甲瓚后，用酶標儀檢測490 nm波長處的吸收值，從而間接反映活細胞數量。MTT法檢測細胞活力具體的實驗步驟為：用胰酶-EDTA溶液消化對數期H295R細胞并收集計數，然后調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL細胞懸液，細胞接種密度根據細胞生長速度調整約為1×103～1×105個細胞/孔，邊緣孔用無菌PBS填充，5% CO2、37 ℃培養24 h。隨后，棄去培養基，DEHP和MEHP母液用DMSO和培養基稀釋，調節各孔DMSO含量為0.1%，加入用新培養基稀釋的不同濃度的DEHP和MEHP(0、1、10、100、1 000 μmol·L-1)在5%CO2、37 ℃繼續培養24 h，接著，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg·mL-1，即0.5% MTT)，繼續培養4 h。小心吸去孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀OD 490 nm或者550 nm處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔(含有培養基、MTT和DMSO)，對照孔(含有細胞、培養液、MTT、DMSO)。細胞存活率%=[(染毒孔OD-調零孔OD)/(對照孔OD-調零孔OD)]×100%。

1.4 RT-PCR分析H295R細胞基因表達變化

將H295R細胞接種到6孔板中，每孔2 mL，在37 ℃、5%CO2培養箱內培養24 h后，除去舊培養基，用新鮮的培養基將DEHP和MEHP配制成以下濃度：0、1、10、100 μmol·L-1染毒，繼續培養24 h。接著，除去培養液，用PBS洗2次，細胞染毒后總RNA的提取采用Omega RNA提取試劑盒，流程按照說明書進行，稍加改動，改動如下：染毒后的細胞，增加了消化步驟以獲得更多的細胞，然后每孔加入1 mL RNA-Solv Reagent，用槍頭反復吹打，使細胞充分裂解；為了使得細胞充分裂解，低溫冰上孵育較長時間(10 min左右)。提取后采用分光光度法鑒定RNA質量，測定RNA濃度，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒在羅氏480儀器上進行熒光定量PCR反應。用于熒光定量PCR的引物序列見表1。以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCT方法分析各染毒組mRNA水平相對于對照組的變化倍數[14]。

圖1 鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP)對H295R細胞活性的影響注：數值以Mean±SEM (n=6)表示；與對照相比，* P<0.05，** P<0.01。Fig. 1 Effects of di-(2-ethylhexyl)-phthalate (DEHP) and mono (2-ethylhexyl) phthalate (MEHP) on cell viability of H295R cellsNote: the representative data are expressed as the mean±SEM, n=6 for each replicate. *P < 0.05, **P < 0.01 vs. control.

1.5 數據統計分析

所有實驗數據采用平均值±標準誤差表示。并進行方差齊性檢驗和正態性檢驗，如有必要需進行對數轉換。采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析(One-Way AVONA)和Turkey’s檢驗。置信水平P<0.05時差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 DEHP和MEHP對H295R細胞活力的影響

為了檢測DEHP和MEHP對H295R細胞的毒性，同時為了確定類固醇合成實驗的處理劑量，本研究采用MTT法對細胞的活性進行分析。如圖1所示，用DEHP處理H295R細胞24 h后，同對照相比，10和100 μmol·L-1DEHP使細胞活性略有下降，但差異未達到統計學意義；1 000 μmol·L-1DEHP使細胞活力顯著降低(P<0.05)(圖1)。MEHP處理H295R細胞24 h后，同對照相比，10和100 μmol·L-1MEHP使細胞活性略有下降，但差異未達到統計學意義；1 000 μmol·L-1MEHP使細胞活力顯著降低(P<0.01)(圖1)。為了檢測類固醇合成相關基因表達的改變，DEHP和MEHP的處理劑量應保持低于對細胞致死效應較強的劑量。因此在H295R類固醇合成實驗中選擇了0、1、10、100 μmol·L-1DEHP和MEHP。

2.2 DEHP對H295R細胞類固醇激素合成通路的影響

在細胞活力測試中，1 000 μmol·L-1DEHP和MEHP對H295R細胞染毒24 h顯著降低H295R細胞活力，對細胞活力影響較強，所以本研究采用了較低的染毒濃度(0、1、10和100 μmol·L-1)對H295R細胞染毒24 h來評估DEHP和MEHP對H295R細胞類固醇合成通路的影響。H295R細胞暴露于DEHP和MEHP(0、1、10、100 μmol·L-1)24 h后，檢測細胞類固醇激素合成過程中關鍵酶基因(CYP11A、CYP11B1、CYP11B2、CYP17、CYP19a、CYP21、17β-HSD1、17β-HSD4、3β-HSD1、3β-HSD2、STAR)和關鍵調控因子NR5A1基因表達水平的變化。

如圖2所示，與對照相比，1、10和100 μmol·L-1DEHP對H295R細胞系染毒24 h后，對編碼類固醇合成通路涉及的多種酶CYP11A、CYP21、CYP11B1、CYP17、3β-HSD1、17β-HSD1、17β-HSD4、CYP19a和STAR的基因表達水平無顯著影響。Nuclear receptor subfamily 5、group A、member 1 (NR5A1/SF-1)類固醇合成因子是在類固醇合成組織中起到關鍵作用的核受體，在腎上腺和性腺的功能和發育過程中起到關鍵的調節作用。DEHP對關鍵類固醇合成因子NR5A1基因表達水平也無顯著影響。然而，1、10和100 μmol·L-1DEHP顯著增加醛固酮合成酶CYP11B2的基因表達水平(P<0.01)。10 μmol·L-1DEHP顯著上調了3-β羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD2)的基因表達水平(P<0.01)。

圖2 DEHP暴露對H295R細胞類固醇合成通路相關基因表達的影響注：數值以Mean±SEM表示(n=3)；與對照組相比，* P<0.05，** P<0.01。Fig. 2 Effects of DEHP on the expression of steroidogenic genes in the H295R cellsNote: the representative data are expressed as the mean±SEM, n=3 for each replicate. *P < 0.05, **P < 0.01 vs. control.

2.3 MEHP對H295R細胞類固醇激素合成通路的影響

如圖3所示，與對照相比，1、10和100 μmol·L-1MEHP對H295R細胞系染毒24 h后，對編碼類固醇合成通路涉及的多種酶如側鏈裂解酶CYP11A、CYP11B1和關鍵類固醇合成因子NR5A1基因表達水平也無顯著影響。然而，與對照相比，1、10和100 μmol·L-1MEHP顯著下調了3-β羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD1和3β-HSD2)、17β羥基類固醇脫氫酶17β-HSD4、17α羥化酶/17,20裂解酶CYP17和芳香酶CYP19a的基因表達水平。10和100 μmol·L-1MEHP染毒H295R 24 h顯著下調了CYP21和STAR的基因表達水平，然而，10和100 μmol·L-1MEHP顯著上調了CYP11B2的基因表達水平。100 μmol·L-1MEHP顯著下調了17β-HSD1的基因表達水平?；虮磉_結果顯示，DEHP、MEHP都可影響H295R細胞類固醇激素合成過程中關鍵基因的表達。

3 討論(Discussion)

本試驗研究了DEHP及其主要代謝產物MEHP對H295R細胞類固醇合成過程的影響，主要包括對類固醇激素合成過程中關鍵酶、關鍵調控因子和關鍵受體基因表達的影響，用以評價DEHP和MEHP的類固醇激素合成干擾效應。研究發現，DEHP、MEHP可不同程度地改變類固醇合成過程中關鍵酶、關鍵調控因子和受體基因的表達。類固醇激素合成是一個復雜的過程，涉及了許多酶、因子和受體的調控，任一調控點的干擾如編碼類固醇合成相關酶的基因表達水平的干擾會引起酶活力的改變，直至激素水平的變化。類固醇合成過程中關鍵酶、因子和受體基因轉錄表達的改變可能造成類固醇激素分泌的紊亂，由于基因表達水平的改變相對于其他毒理效應檢測指標較靈敏[15]，為了揭示DEHP和MEHP對H295R細胞產生類固醇激素合成干擾效應的分子機制，我們選擇基因表達水平的改變來評估DEHP和MEHP對H295R細胞類固醇激素合成干擾的影響。H295R細胞在許多研究中已被用于評估一些內分泌干擾化合物改變類固醇合成通路相關基因表達的能力[16]。

圖3 MEHP暴露對H295R細胞類固醇合成通路相關基因表達的影響注：數值以Mean±SEM表示(n=3)；與對照組相比，* P<0.05，** P<0.01。Fig. 3 Effects of MEHP on the expression of steroidogenic senes in the H295R cellsNote: the representative data are expressed as the mean±SEM, n=3 for each replicate. *P < 0.05, **P < 0.01 vs. control.

3.1 DEHP和MEHP對H295R細胞中類固醇生物合成關鍵基因表達水平的影響

熒光定量qRT-PCR用于檢測DEHP和MEHP調節H295R細胞中類固醇生物合成關鍵基因表達水平。DEHP顯著增加醛固酮合成酶CYP11B2的基因表達水平，對CYP11B1基因表達水平無顯著影響。類似地10和100 μmol·L-1MEHP顯著上調了CYP11B2的基因表達水平，而MEHP染毒對CYP11B1基因表達水平無顯著影響。DEHP和MEHP對CYP11B1和CYP11B2基因在轉錄水平上產生了不同程度的影響，這可能和CYP11B1和CYP11B2的結構差異和調節通路不同有關系。CYP11B1是一種催化皮質醇生物合成過程的最后步驟線粒體細胞色素酶，CYP11B1和CYP11B2的內含子共享了90%的核酸序列，外顯子區域共享了95%的核酸序列，并且CYP11B1在染色體8q上靠近CYP11B2，然而這2個基因的表達定位于腎上腺皮質不同的帶狀區域[16]。CYP11B1和CYP11B2調節模式的不同還可能是由于CYP11B1和CYP11B2是通過不同通路調節的，CYP11B2是ACTH/cAMP、血管緊張素angiotensin II、類固醇合成因子1(SF-1)結合位點和cAMP響應元素(CRE) 2種元素來調節的[17]，然而，CYP11B1的表達是ACTH通過cAMP和蛋白激酶A依賴于cAMP響應結合蛋白家族成員(ATF-2)而非SF-1來激活的[18]。DEHP對3-β羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD1)的基因表達水平無顯著影響，而10 μmol·L-1DEHP顯著上調了3-β羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD2)的基因表達水平，3β羥化類固醇脫氫酶(3β-HSD)對包括醛固酮、皮質醇和睪酮在內的所有類固醇激素的生物合成都很重要。3β-HSD1和3β-HSD2是定位于染色體1p13.1的2個基因，編碼不同的3β-HSD同功酶[19]。3β-HSD1和3β-HSD2的DNA序列和編碼序列之間的內含子部分高度同源[20]。這說明盡管H295R細胞3β-HSD1和3β-HSD2在基因序列和酶的功能具有很大的相似性，但它們的表達調節模式可能不同。然而各MEHP處理組顯著下調了H295R細胞3β-HSD1和3β-HSD2基因表達水平。DEHP對H295R細胞芳香化酶CYP19a的基因表達水平無顯著影響，而各MEHP處理組顯著下調了H295R細胞CYP19a基因表達水平。CYP19a是負責將雄激素轉化為雌激素的最后步驟限速酶，最近很多研究提出具有改變CYP19活性能力的化合物具有內分泌干擾效應[21]，所以MEHP具有內分泌干擾效應。

DEHP對H295R細胞類固醇激素合成過程中其他的關鍵酶和調節因子的基因表達水平無顯著改變。然而10和100 μmol·L-1MEHP染毒H295R 24 h顯著下調了CYP21基因表達水平，CYP21基因產物是在醛固酮和皮質類固醇合成過程中需要的酶，這種酶的缺失可導致不產生皮質醇和醛固酮[22]。并且，各MEHP處理組顯著下調了CYP17的基因表達水平，CYP17催化了醛固酮向皮質類固醇底物的轉化并最終向性固醇激素底物的轉化，MEHP通過抑制CYP17的基因表達可能抑制了性固醇激素底物的合成，一些化合物如酮康唑(ketoconazole)也同時抑制CYP21和CYP17的基因表達水平[23]。17β-HSD是類固醇合成酶的一個相對較大的家族，17β-HSD1催化還原反應，17β-HSD1將雌酮轉化為生物學活性更強的17β雌二醇，相反，17β-HSD4是將生物學活性較強的類固醇如雌二醇轉換為生物學活性較弱的類固醇如雌酮的氧化酶[24]。100 μmol·L-1MEHP顯著抑制17β-HSD1的基因表達水平，可能導致雌酮向雌二醇的轉化受到抑制。而各MEHP處理組顯著抑制17β-HSD4的基因表達水平，可能抑制雌二醇轉換為雌酮。許多化合物如異黃酮等也抑制17β-HSD的表達水平[24]。10和100 μmol·L-1MEHP染毒H295R 24 h顯著抑制STAR的基因表達水平，從而可能抑制膽固醇從線粒體外膜向線粒體內膜的轉運，從而影響類固醇激素的合成。

3.2 DEHP及MEHP干擾H295R細胞類固醇合成機制的異同點

DEHP和MEHP對類固醇激素合成相關基因表達的影響既有相同之處又有不同之處。在本研究中DEHP和MEHP都顯著上調了CYP11B2的基因表達水平，而對CYP11B1基因表達水平無顯著影響。DEHP對3-β羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD1)的基因表達水平無顯著影響，而10 μmol·L-1DEHP顯著上調了3-β羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD2)的基因表達水平，然而各MEHP處理組顯著下調了H295R細胞3β-HSD1和3β-HSD2基因表達水平。DEHP對H295R細胞芳香化酶CYP19a的基因表達水平無顯著影響，而各MEHP處理組顯著下調了H295R細胞CYP19a基因表達水平。DEHP對H295R細胞類固醇激素合成過程中其他的關鍵酶和調節因子的基因表達水平無顯著改變。而MEHP抑制了STAR、CYP17、CYP19a、3β-HSD1、3β-HSD2、17β-HSD1、17β-HSD4、CYP21基因的表達，所以MEHP可以通過抑制STAR基因的表達，從而將影響類固醇激素合成前體膽固醇在細胞內的轉運；并能顯著性抑制類固醇激素合成過程中CYP17、CYP19a、3β-HSD1、3β-HSD2、17β-HSD1、17β-HSD4、CYP21基因的表達，最終將抑制H295R細胞中類固醇激素的合成。并且與DEHP相比，MEHP對H295R細胞類固醇激素合成關鍵基因表達的影響較明顯。所以在評價DEHP對H295R細胞類固醇激素合成通路影響時，可選擇CYP11B2和3β-HSD2作為分子靶標，而對于評價MEHP對H295R細胞類固醇激素合成通路影響時，可選擇STAR、CYP17、CYP19a、3β-HSD1、3β-HSD2、17β-HSD1、17β-HSD4、CYP21基因作為分子靶標。類似地，文獻研究顯示MEHP暴露囊狀卵泡導致類固醇激素合成過程涉及的關鍵酶CYP19A1、3β-HSD1、STAR、CYP11A1、CYP17A1、17β-HSD1 mRNA水平，最終導致睪酮、雌酮和雌二醇水平下降[25]，該研究結果也顯示DEHP和MEHP對類固醇激素合成過程的干預模式是不同的。一些文獻研究也報道DEHP的毒性效應是由MEHP介導的，體外MEHP暴露抑制了類固醇激素合成[26-27]。體內實驗研究顯示圍產期暴露于DEHP下調了睪丸間質細胞類固醇激素合成相關基因如StAR、Cyp11a1、3β-HSD、17β-HSD和Cyp-19等的表達，從而顯著降低血清睪酮和雌二醇水平并導致內分泌干擾生殖毒性效應[28]。然而，也有報道顯示體外研究中低劑量DEHP和MEHP(0.001 μmol·L-1和0.1 μmol·L-1)暴露MLTC-1細胞增加了類固醇激素合成相關基因CYP11A1、CYP17和3β-HSD從而刺激了睪酮的分泌[29]，這種研究結果的差異可能是由于種屬差異導致的。DEHP和MEHP對H295R細胞類固醇激素合成相關基因表達水平影響的差異可能是由于DEHP在H295R細胞內并非完全發生代謝轉化為MEHP，H295R細胞體內負責將DEHP轉化為MEHP，次級代謝產物的代謝酶如乙醛脫氫酶、酒精脫氫酶和脂蛋白酯酶的水平和活性受到DEHP暴露的影響，DEHP代謝轉化為MEHP的轉化率以及MEHP進一步代謝轉化為其他次級代謝產物的轉化率需要進一步的研究，以便解釋DEHP和MEHP對類固醇生成相關基因表達影響的差異機制。

對比DEHP和MEHP對H295R細胞類固醇激素合成通路的影響，可知DEHP和MEHP對H295R細胞類固醇激素合成通路相關酶、因子和受體基因表達水平的影響不同，并且與DEHP相比，MEHP對H295R細胞類固醇激素合成關鍵基因表達的影響較明顯。