PM2.5和甲醛聯合暴露致小鼠肺損傷及其分子機制的研究

閤靜，趙云，黃佳偉，張萍，潘雯，尤安琪，黃希，楊旭，李睿

華中師范大學生命科學學院，武漢 430079

2016年，世界衛生組織發布報告指出，世界上92%的人口生活在空氣質量水平超過世界衛生組織限值的地區[1]。在我國，當前最為關注的城市室外和室內空氣污染物分別是PM2.5和甲醛[2-3]。

大氣PM2.5，指空氣動力學等效直徑≤2.5 μm的細顆粒物，是我國近年來對人體健康影響最大的空氣污染物。吸附了不同污染物的PM2.5被吸入到肺組織后，可通過微血管擴散到血液中，引起肺癌、呼吸道疾病、心血管疾病[4-5]，以及免疫系統和造血系統疾病等健康問題[6-7]。謝元博等[8]發現，PM2.5每增加10 μg·m-3，北京市健康居民哮喘發病率增加2.10%。另外，2016年《環境衛生展望》(EnvironmentalHealthPerspectives，EHP)雜志上的一文指出，PM2.5濃度增加量即使低至4.00～7.06 μg·m-3，都與健康人群哮喘的患病率上升相關[9]。上述研究表明，室外大氣PM2.5與哮喘發病率相關，其暴露可引起肺組織損傷。

甲醛作為一種重要的化工原料，廣泛應用于建筑、木材加工、家具、紡織品等產業。它對人體健康的負面影響涉及多個組織器官，主要表現為眼部和呼吸道的刺激作用，呼吸道紊亂、哮喘或類似哮喘的病癥，長期接觸甲醛還可導致鼻腔、鼻咽、消化道和皮膚的癌變，以及白血病等造血系統惡性腫瘤[10]。岳偉等[11]在甲醛暴露和成人哮喘關系的病例對照研究中指出，甲醛濃度超過0.12 mg·m-3后，室內甲醛每升高10 μg·m-3，健康成人哮喘危險性提高0.2倍。澳大利亞Rumchev等[12]研究發現，甲醛暴露水平達到或超過0.60 mg·m-3時，健康兒童發生哮喘的危險度就會增加。上述2項研究表明，甲醛暴露可以誘導健康成人和兒童發生哮喘，且兒童的對甲醛的敏感性更高。

目前，無論流行病學或是實驗研究，都主要關注室外大氣PM2.5和甲醛的單獨暴露效應，二者聯合暴露效應在環境學界的研究迄今為止鮮有報道。2016年中國環境狀況公報數據顯示，2016年80%城市PM2.5濃度超過我國環保部的安全標準35 μg·m-3[3]。此外，目前我國城市室內甲醛超標居室比例高達70%[13]?；赑M2.5和甲醛超標污染的客觀情況，二者復合暴露更接近于我國城市居民的真實生活環境。因此，研究二者聯合暴露的健康效應非常必要。本項研究中，通過肺組織病理學觀察、氧化應激、DNA損傷及細胞凋亡等生物學指標的檢測，從而探討PM2.5和甲醛單一及復合暴露誘導產生小鼠肺損傷的可能機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

SPF級6周齡雄性Balb/c小鼠(約22 g)購自湖北省疾病預防控制中心。購買回來后在動物飼養室繼續飼養1周，待其適應新環境后再進行實驗。動物飼養室的環境條件為：溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%，光暗循環周期為12 h:12 h。

1.2 主要試劑與儀器

福爾馬林(10%，Sigma公司)，PM2.5染毒液(采集于華中師范大學)，AZD8055(Abmole Bioscience公司)，GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠8-OH-dG ELISA試劑盒(Blue Gene)，小鼠Caspase-3 ELISA試劑盒(Blue Gene)，蛋白酶K(Merck)，Hoechst 33258熒光染料(Sigma公司)，小型智能環境氣候倉(WH-2)，氣態甲醛濃度測定儀(4160-2)，全波長/熒光酶標儀(Bio-tek)，全波長酶標儀(DNM-9602)。

1.3 實驗方法

1.3.1 PM2.5樣品制備

2015年10月—2016年1月，在華中師范大學建筑物樓頂(高10 m左右，周圍沒有明顯的污染源)放置Thermo Anderson G-2.5大流量釆樣器(美國熱電子公司)，采用石英纖維濾膜(英國Whatman公司)采集大氣PM2.5。采樣后將采有PM2.5的濾膜裁剪為長寬均為l cm，浸入去離子水中，超聲振蕩15 min，重復3次，洗脫PM2.5，振蕩液用6層紗布過濾，濾液冷凍真空干燥(Labconco，USA)，低溫冰箱保存備用。暴露時，用無菌生理鹽水配制成相應濃度懸液。

1.3.2 實驗動物分組與暴露方案

實驗采用48只SPF級雄性Balb/c小鼠，隨機分為6組，每組8只小鼠。FA采用職業氣態暴露方式(3 mg·m-3，8 h·d-1，5 d·w-1，2 w)，PM2.5采用氣道滴注的暴露方式(2.5 mg·mL-1，40 μL·次-1，3次·w-1，2 w)。介導DNA損傷修復哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)特異性的阻斷劑AZD8055采用灌胃的方式進行暴露，暴露的劑量為20 mg·kg-1·d-1。實驗動物分組與暴露方案如圖1所示。

1.3.3 肺組織勻漿液制備

第12天染毒結束之后，將小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠肺組織，稱重，加入一定量預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用玻璃勻漿器在0～4 ℃下制成10%的組織勻漿液，將勻漿液以10 000 r·min-1離心15 min，取上清備用。

1.3.4 生化指標測定

小鼠肺蛋白含量測定：Folin-酚法測定小鼠肺組織勻漿的蛋白含量，具體實驗步驟按照試劑盒說明書標準操作規范進行。ROS含量測定：采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)法，取小鼠肺組織勻漿并用PBS稀釋100倍。每孔100 μL加入酶標板中。加入10 mmol·L-1的DCFH-DA 100 μL，在37 ℃下避光保存10 min后，在480 nm激發光、520 nm 發射光下測量其熒光強度。GSH含量測定：具體實驗步驟按照所使用試劑盒說明書標準操作規范進行。MDA含量測定：采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法。取10 mL試管，每管加入0.5 mL待測樣品液，然后各管加入2 mL 6%TBA溶液，混勻后沸水浴15 min，取出后流水冷卻。10 000 r·min-1離心10 min，取上清液分別在450 nm、532 nm和600 nm波長下測定吸光值，按C(μmol·L-1) = [6.45 (A532-A600) -0.56A450]/蛋白濃度，計算出每管樣品中MDA的濃度。DPC系數測定：采用KCl-SDS沉淀法。向樣品中加入100 mmol·L-1KCl可形成十二烷基硫酸鉀-蛋白質沉淀聯合物，而游離的DNA留在上清液中。將上清轉移后，向沉淀加入蛋白酶K消化與DNA交聯的蛋白質，使交聯的DNA釋放出來。再加入熒光染料Hoechst 33258對DNA染色，測定熒光值即可得出DNA的相對含量。最后通過公式來計算DPC系數，DPC=交聯DNA含量/(交聯DNA含量+游離DNA含量)。8-OH-dG和Caspase-3含量測定：使用雙抗體夾心ELISA法測定,具體實驗步驟按照所使用試劑盒說明書標準操作規范進行。

圖1 實驗動物分組與暴露方案Fig. 1 Experimental groups and exposure scheme

1.3.5 小鼠肺組織切片

從氣管開始小心剝離完整的肺，之后在預冷的生理鹽水中沖洗干凈肺表面的血跡，做好標記后浸沒于固定液中。48 h后，經脫色、清洗、染色、脫水等處理后用石蠟包埋，切成約10 μm的薄片，制成永久裝片。

1.4 統計學分析

實驗數據用平均值±標準差表示。用GraphPad Prism 5軟件作圖，SPSS 13.0軟件對數據進行統計學分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，Turkey多重比較(multiple comparisons)檢驗組間均值的差異顯著性，顯著水平α定為P<0.05。

2 結果(Results)

2.1 小鼠一般體征和體重的變化

對照組小鼠皮毛干爽光滑，精神狀態良好，喜動而不喜臥。染毒2周后，與對照組相比，PM2.5+FA組和PM2.5+FA+AZD8055組小鼠的毛汗濕豎立，精神萎靡，喜擠臥而不喜動。小鼠體重的變化如圖2所示，各染毒組小鼠的體重與對照組相比都出現不同程度的降低(P>0.05)。

圖2 小鼠體重變化Fig. 2 Body weight change in mice

2.2 小鼠肺組織氧化應激指標測定結果

染毒2周后，小鼠肺組織ROS含量變化如圖3A所示，與對照組相比PM2.5組、FA組、PM2.5+FA組以及PM2.5+FA+AZD8055組的ROS水平都顯著上升(P<0.001)；分別與PM2.5、FA單獨暴露組相比，PM2.5+FA組的ROS含量的增加也具有顯著差異(P<0.001)；與PM2.5+FA組相比，PM2.5+FA+AZD8055組的ROS含量顯著性增加(P<0.05)。小鼠肺組織GSH含量變化如圖3B所示，與對照組相比，各組GSH水平均表現為顯著性下降(P<0.01或P<0.001)；相比于PM2.5組，PM2.5+FA組中GSH含量顯著性降低(P<0.05)。小鼠肺組織MDA含量變化如圖3C所示，與對照組相比，PM2.5組的MDA水平顯著性上升(P<0.05)，FA組，PM2.5+FA組和PM2.5+FA+AZD8055組MDA水平顯著性上升(P<0.01)；與PM2.5組相比，PM2.5+FA組MDA水平顯著性上升(P<0.05)；相比與PM2.5+FA組，PM2.5+FA+AZD8055組MDA水平顯著上升(P<0.05)。

2.3 小鼠肺組織DNA損傷測定結果

小鼠肺組織DPC含量變化如圖3D所示，與對照組相比，各組DPC水平均顯著性上升(P<0.01或P<0.001)。小鼠肺組織8-OH-dG含量變化如圖3E所示，與對照組相比，FA組8-OH-dG含量顯著上升(P<0.05)；PM2.5組，PM2.5+FA組和PM2.5+FA+AZD8055組8-OH-dG含量顯著上升(P<0.01)；與PM2.5、FA單獨暴露組相比，PM2.5+FA組8-OH-dG含量顯著上升(P<0.01)。

2.4 小鼠肺組織凋亡Caspase-3含量測定結果

圖3F顯示，相比于對照組，各組Caspase-3含量顯著上升(P<0.001)。與PM2.5組、FA組單獨暴露組相比，PM2.5+FA組Caspase-3含量顯著性(P<0.05)上升。

2.5 肺組織H&E染色

肺組織H&E染色切片鏡檢結果如圖4所示，對照組和AZD8055組小鼠的肺組織切片表現為氣道組織上皮結構完整，氣道壁光滑，沒有明顯的細胞浸潤，氣道平滑肌細胞為單層排列。PM2.5組和FA組小鼠的肺組織切片表現為氣道壁增厚，氣道皺縮，周圍出現以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。從PM2.5+FA組和PM2.5+FA+AZD8055組可以看出，氣道表皮出現了嚴重的皺縮、斷裂，氣管周圍與肺泡腔出現大量的炎癥細胞浸潤。

3 討論(Discussion)

近年來的研究發現，生理水平的ROS可作為信號分子參與細胞增殖、遷移、分化和基因表達等生命過程。當機體受到外界不良因素刺激時，過量生成的ROS可以耗竭體內GSH，造成機體中生物大分子過氧化，其中MDA是脂質過氧化的主要產物之一[14]。持續的氧化應激會導致包括Caspase-3在內的凋亡因子釋放，使線粒體功能失調，產生細胞凋亡[15]。本研究中，PM2.5復合甲醛暴露后，小鼠肺組織中ROS和MDA含量出現顯著性上升，GSH含量下降，表明PM2.5聯合甲醛暴露可以使機體抗氧化能力降低，導致肺組織產生氧化損傷。此外，二者單獨暴露均會導致肺組織中Caspase-3含量顯著升高，復合暴露可顯著提升小鼠肺組織Caspase-3水平。由此推測，PM2.5與甲醛共同作用導致小鼠肺組織產生強烈的氧化應激，從而誘導凋亡因子釋放和線粒體功能失調，引發細胞凋亡。

圖3 小鼠肺組織氧化應激、 DNA損傷、細胞凋亡測定結果注：與對照相比，* P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與PM2.5+FA組相比，#P<0.05，## P<0.01，### P<0.001。Fig. 3 The oxidative stress, DNA damage, apoptosis levels in the lung tissueNote: Compared with control group, * P<0.05, **P<0.01,***P<0.001; compared with PM2.5+FA group, # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001.

圖4 小鼠肺組織切片H&E染色注： A，對照組；B，AZD8055組；C，PM2.5組；D，FA組；E，PM2.5+FA組；F，PM2.5+FA+AZD8055組。黑色箭頭為支氣管重塑；藍色箭頭為炎癥細胞浸潤。Fig. 4 Histopathological changes of mouse lung tissue stained with H&ENote: A, Control group; B, AZD8055 group; C, PM2.5 group; D, FA group; E, PM2.5+FA group; F, PM2.5+FA+AZD8055 group. Black arrows indicate bronchial remodeling；blue arrows indicate inflammatory cells infiltration.

此外，過量的ROS還能攻擊DNA分子，形成穩定的共價化合物8-OH-dG嚴重影響DNA分子的構象與功能，阻礙正常的基因的復制與轉錄翻譯過程[16]。體內和體外實驗研究均表明，甲醛可以誘導大鼠肺組織DNA生成8-OH-dG，且呈現劑量效應[17]，而Longhin等[18]研究發現，PM2.5暴露會導致8-OH-dG含量的增加。本研究中，PM2.5聯合甲醛暴露后，小鼠肺組織8-OH-dG含量增加，由此說明，PM2.5和/或甲醛暴露能通過過量ROS從而引起小鼠產生DNA損傷。DPC是甲醛誘發DNA損傷的主要形式，由DNA和蛋白質共價交聯形成。甲醛作為交聯劑直接導致與之接觸的組織和細胞形成過量DPC，影響了DNA的結構和功能[19-20]。本研究中，PM2.5和甲醛單獨暴露均會導致肺組織DPC的形成，且PM2.5和甲醛復合暴露可顯著增加DPC的含量。由此推測，可能由于二者共同暴露導致肺組織發生氧化應激，產生大量ROS，繼而介導了8-OH-dG和DPC形成，造成嚴重的DNA損傷效應。

正常情況下，當DNA損傷發生時，機體可啟動DNA損傷修復，其中，mTOR可通過mTORC1-S6K1激活范可尼貧血互補群基因D2(Fanconi anemia complementation group D2，FANCD2)，進而激活ATM-Chk2檢驗點來修復DNA損傷，從而減少DNA分子損傷[22]。Guo等[22]的研究也表明，當小鼠mTOR基因被敲除后，FANCD2蛋白表達下調，進而導致了DNA的損傷，由此說明mTOR參與了DNA損傷的修復。AZD8055作為mTOR分子的特異性抑制劑，能夠特異性阻斷DNA的損傷修復，從而加重DNA的損傷[23]。本研究中，使用阻斷劑AZD8055后可使暴露于PM2.5和甲醛的小鼠體內DPC和8-OH-dG含量顯著上升，從而進一步驗證了AZD8055能夠阻斷mTOR介導的DNA損傷修復途徑，從而加重DNA的損傷。

綜上，本研究表明，PM2.5，甲醛暴露后小鼠肺組織發生病變，肺組織出現氧化損傷、DNA損傷和細胞凋亡的現象，導致了小鼠的肺損傷。PM2.5和甲醛聯合暴露會加重小鼠肺損傷，表現為協同作用。而復合暴露導致肺部的氧化損傷，因破壞DNA損傷修復而加重的DNA損傷，以及細胞凋亡可能是聯合暴露導致肺損傷的重要機制。PM2.5和甲醛復合暴露肺損傷對解釋我國哮喘的發病率居高不下具有一定的提示作用。

致謝：感謝科技部十三五國家重點研發計劃(No：2017YFC0702700)和國家自然科學基金(No: 21577045)對本研究的資助。