納米銀和PVP包被納米銀對HepG2細胞遺傳毒性的比較研究

王秀娟，李婷竹，陸強，蘇雪榮，薛玉英,*，唐萌

1. 環境醫學工程教育部重點實驗室，南京 210009 2. 東南大學公共衛生學院 & 蘇州納米科技協同創新中心，南京 210009 3. 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，南京 210009

隨著納米技術的飛速發展，納米產品層出不窮。在眾多的納米材料中，納米銀因其優良的抗菌殺菌性能被廣泛應用于醫療衛生、食品加工、化妝品、陶瓷、紡織、半導體材料，水質凈化等領域[1]。廣泛的應用使人體暴露納米銀的機會大大增加，有研究表明，納米銀可能與體內不同組織、細胞或生物分子產生相互作用[2-5]，帶來潛在的安全隱患，評估其生物安全性至關重要。

遺傳毒性在安全性評價中不可或缺，有研究者用粒徑為55 nm的納米銀對SD大鼠在其懷孕的第7～20天，每天分別以 0、0.2、2、20 mg·kg-1的劑量進行灌胃，結果發現納米銀可穿越胎盤屏障，到達胎鼠體內，并引起孕鼠及子鼠體內氧化應激水平的改變[6]。Wen等[7]用納米銀(6.3～629 nm)對大鼠以5 mg·kg-1的劑量進行靜脈染毒，結果發現與空白對照組相比實驗組大鼠染色體斷裂和多倍體細胞率顯著增加，表明納米銀具有潛在的遺傳毒性。Tavares等[8]用納米銀(5～45 nm)染毒人外周血細胞，彗星實驗結果表明在各染毒劑量下(10、25、50 μg·mL-1)納米銀均會對細胞產生基因毒性作用，但隨著時間的推移納米銀對DNA的損傷逐漸減少，說明在低劑量染毒細胞時，隨著時間的增加，納米銀對細胞造成的遺傳毒性會因為細胞修復系統而降低。目前，關于納米銀的體外遺傳毒性研究還不是很充分，有待進一步探索。

本研究選擇人肝癌(HepG2)細胞株為研究對象，以無包被納米銀和PVP包被納米銀為材料，通過彗星實驗和胞質分裂阻滯微核細胞組學試驗研究納米銀對DNA、染色體的影響，從多遺傳終點和遺傳毒作用機制角度出發，通過分析、比較2種納米銀的遺傳作用特征，較全面地分析納米銀遺傳毒性的劑量-效應關系，為納米材料體外遺傳毒性評估提供實驗依據。此外，本研究確定了由彗星實驗與胞質分裂阻滯微核細胞組學試驗結合的方法，利用HepG2細胞作為體外評價模型，能方便快速檢測納米銀材料的遺傳毒性效應，進而可以利用該組合實驗篩檢市場中納米材料的遺傳毒性效應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與細胞

20 nm PVP包被納米銀粉體(上海滬正納米科技有限公司)，20 nm 無包被納米銀粉體(上海允復納米科技有限公司)，重鉻酸鉀(K2Cr2O7，國藥集團化學試劑有限公司)，陽性對照絲裂霉素C(Mitomycin C, MMC, Sigma-Aldrich公司)，HepG2細胞株(Human hepatoma cell line，人肝癌細胞，中國科學院上海細胞生物研究所)。

1.2 試劑

DMEM高糖培養液(美國GE公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，博士德生物工程有限公司)，細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，Oxiselect彗星實驗試劑盒(Oxiselect comet assay kit，美國Cell Biolabs公司)，TE緩沖液(北京天恩澤生物技術有限公司)，氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，氫氧化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，75%酒精(永華化學科技(江蘇)有限公司)，細胞松弛素-B(Cytochalasin B，Cyt-B，CAS：14930-96-2，美國Sigma -Aldrich 公司)，吉姆薩粉末(Giemsa，中國Biosharp公司)。

1.3 主要儀器

3423型CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)，TDZ6B-WS水平離心機(上海盧湘儀器廠)，5424R型離心機(德國Eppendorf公司)，KQ-2200E型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)，FSX100型智能生物圖像導航儀(日本OLYMPUS公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養

HepG2細胞使用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)于37 ℃、CO2體積分數為5%條件下常規傳代培養。

1.4.2 Hoechst-33258染色測細胞凋亡

將潔凈蓋玻片置于6孔板內，取對數生長期的細胞接種于6孔板，調節細胞濃度為1×105個·mL，每孔2 mL，培養過夜，使其密度至50%～80%滿。后分別用20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1的納米銀染毒細胞。24 h后，吸盡培養液，加入0.5 mL固定液，固定10 min，去固定液。用PBS洗2遍，每次3 min，吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，置搖床上染色5 min。去染色液，用PBS洗2遍，吸盡液體。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。在生物導航儀上觀察細胞。

1.4.3 彗星實驗

取對數生長期的細胞接種于12孔板，調節細胞密度至1×105個·mL，每孔1 mL。培養24 h后吸去原培養液，空白對照組加入細胞培養液，陽性對照組加入294 μg·mL-1的重鉻酸鉀溶液，實驗組分別加入20、40、80、160 μg·mL-1的納米銀溶液，繼續培養24 h后，收集細胞。按照彗星實驗試劑盒操作說明檢測DNA損傷。實驗重復3次，每次實驗每個劑量隨機選擇50個細胞用Comet Assay軟件(CASP，http://casplab.com/)分析。3次實驗的Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比的平均值用以表達DNA損傷。

1.4.4 胞質分裂阻滯微核細胞組學試驗

取對數生長期的細胞接種于12孔板，調節細胞密度至1×105個·mL，每孔1 mL。培養24 h后吸去原培養液，實驗組分別加入20、40、80、160 μg·mL-1的納米銀溶液，陽性對照組加入0.1 μg·mL-1的絲裂霉素C，胞質阻滯松弛素B在染毒時同時加入，濃度為4 μg·mL-1，染毒24 h后，吸去染毒液將細胞固定滴片，后用Giemsa 染液進行染色，最后用生物導航儀讀片，對2種納米銀每個染毒劑量均觀察3次不同區域的細胞，每次觀察1 000個雙核細胞，統計1 000個細胞中總微核(Ⅰ型微核+Ⅱ型微核)、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核芽、核質橋的數量。

1.5 統計學方法

2 結果(Results)

2.1 納米銀表征結果

透射電鏡(TEM)檢測結果如圖1所示，通過TEM觀察到分散于10%胎牛血清的DMEM培養液中的2種納米銀顆粒均為球形，無包被的納米銀有團聚現象，PVP包被的納米銀分散均勻，無團聚現象。通過Nano Measurer 1.2.5 軟件測量20 nm無包被納米銀平均粒徑為(18.29±5.50) nm，20 nm PVP包被的納米銀平均粒徑為(19.95±4.75) nm。

2.2 納米銀對HepG2細胞凋亡的影響

生物導航儀讀片可見陽性對照組凋亡細胞比較多，各處理組有少量的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，其他都為正常的細胞核形態，正常細胞核內DNA分布相對均勻，細胞核無固縮，在視野中呈現體積較大的且染色顏色較淺的核形態，納米銀對HepG2細胞核形態的影響見圖2，各實驗處理組HepG2 細胞凋亡率結果見表1。

圖1 納米銀顆粒TEM圖注：A, 20 nm AgNPs的TEM圖； B, 20 nm-PVP AgNPs的TEM圖。Fig. 1 The TEM diagram of nano silver particlesNote: A, the TEM diagram of 20 nm AgNPs; B, the TEM diagram of 20 nm-PVP AgNPs.

圖2 不同特性納米銀對HepG2細胞核形態的影響注：Hoechst 33258染色，×100，箭頭所指為凋亡細胞的細胞核。A，空白對照組；B，陽性對照組；C1～C4，20 nm AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80, 160 μg·mL-1)；D1～D4，20 nm PVP-AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80 160 μg·mL-1。Fig. 2 The influence of different characteristics of nano silver on the nuclear form of HepG2Note: Hoechst 33258 staining, ×100; the arrow refers to the nucleus of apoptotic cells. A, blank control group; B, positive control group; C1-C4, 20 nm AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1); D1- D4, 20 nm PVP-AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1).

表1可知，與正常對照組比較，20 nm AgNPs組在劑量為160 μg·mL-1時凋亡細胞核相比于空白對照組明顯增多(P<0.05)；20 nm PVP-AgNPs的80 μg·mL-1、160 μg·mL-1組凋亡細胞核相比于空白對照組明顯增多(P<0.05，P<0.01)。2種納米銀使HepG2細胞呈濃度依賴性的細胞凋亡(20 nm AgNPs：P<0.05，r=0.997；20 nm PVP-AgNPs：P<0.05，r=0.999)。析因設計方差分析比較可知，20 nm PVP-AgNPs對HepG2細胞凋亡的影響大于20 nm AgNPs(P<0.05)。

圖3 彗星圖像(×42)注：A，空白對照組；B，陽性對照組；C1～C4，20 nm AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80,160 μg·mL-1)；D1～D4，20 nm PVP-AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80,160 μg·mL-1)。Fig. 3 The comet image (×42)Note: A, blank control group; B, positive control group; C1-C4, 20 nm AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1); D1- D4, 20 nm PVP-AgNPs group (20, 40, 80,160 μg·mL-1).

表1 不同特性納米銀對HepG2細胞凋亡率的影響Table 1 The effect of silver nanoparticles with different properties on the apoptosis rate of HepG2 cells

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。Note: Compared with the control group,aP<0.05，bP<0.01.

2.3 納米銀對DNA損傷的影響

實驗所得彗星圖像見圖3，空白對照組彗星頭部DNA致密，無尾部；陽性對照組頭部DNA集中，亮度很強，尾部由DNA斷片組成呈掃帚狀，熒光強度不及頭部。2種納米銀處理組中小于等于40 μg·mL-1劑量組均能觀察到頭部DNA致密，無明顯尾部或尾部很短；大于等于80 μg·mL-1的各個劑量組的彗星頭部DNA集中，亮度較強，尾部成呈掃帚狀，熒光強度不及頭部。利用彗星分析軟件(Comet Assay Software Project, CASP)進行數據分析，2種不同包被納米銀的不同濃度的Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比結果見表2。

由單因素方差分析結果可知，在染毒24 h后，陽性對照組Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比與空白對照組對比有顯著差異(P<0.01)。20 nm AgNPs組中除了20 μg·mL-1的Olive尾矩與尾長，其余均與空白對照組有顯著差異(P<0.05)，20 nm PVP-AgNPs組除了20 μg·mL-1的DNA百分比，其余均與空白對照組差異有統計學意義(P<0.05)。析因設計方差分析比較可知，2種納米銀使HepG2細胞DNA斷裂程度：20 nm AgNPs > 20 nm PVP-AgNPs(P<0.05)。

2.4 納米銀對細胞核的影響

如圖4，胞質分裂阻滯微核細胞組學試驗中，納米銀引起細胞核出現Ⅰ型微核數、Ⅱ型微核、核芽、核質橋等特征性改變，不同特性納米銀染毒HepG2細胞微核組學效應見表3。

如表3所示，與陰性對照組相比，20 nm AgNPs 在80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細胞后微核總數顯著升高 (P<0.01)；20 nm PVP-AgNPs在20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細胞后微核總數均顯著升高 (P<0.01)。20 nm AgNPs在80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細胞后Ⅰ型微核數顯著升高(P<0.01)；20 nm PVP-AgNPs在20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細胞后Ⅰ型微核數均顯著升高(P<0.01)。與陰性對照組相比，2種納米銀材料在160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細胞后Ⅱ型微核數均顯著升高(20 nm AgNPs，P<0.05；20 nm PVP-AgNPs，P<0.01)。20 nm AgNPs在160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細胞后核芽數顯著升高(P<0.05)；20 nm PVP-AgNPs在40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細胞后核芽數均顯著升高(P<0.01)；與陰性對照組相比，2種納米銀各濃度劑量下核質橋數均無顯著差異(P>0.05)。各效應指標的組間比較結果發現，除核質橋外，2種納米銀材料引起的總微核數、Ⅰ型微核數、Ⅱ型微核數、核芽數均有差異(P<0.05)，20 nm PVP-AgNPs對細胞核的影響大于20nm AgNPs。直線相關分析結果發現，20 nm AgNPs組中，除核質橋外，各效應指標均有隨染毒劑量增高而增高的趨勢(P<0.05，r>0.7)，20 nm PVP-AgNPs組中，除核質橋和核芽外，其他效應指標均有隨染毒劑量增高而增高的趨勢(P<0.05，r>0.7)，表明納米銀對HepG2細胞的遺傳毒性損傷存在一定的劑量-效應關系。

表2 2種納米銀染毒HepG2細胞Olive尾矩、尾長、尾部DNA比值結果Table 2 The results of Olive tail moment, tail length and tail DNA ratio of HepG2 cells exposed to two kinds of nano silver

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。Note：Compared with the control group,aP<0.05，bP<0.01.

3 討論(Discussion)

在納米銀的生產和應用過程中，常用不同材料對納米銀進行表面修飾以改善其分散性和穩定性，如PVP、檸檬酸鈉和多聚糖等，不同包被的納米銀可能影響與細胞的相互作用[9]。Ahamed等[10]用25 nm多聚糖包被的納米銀和未包被的納米銀以50 μg·mL-1對鼠胚胎干細胞與鼠胚胎纖維母細胞進行染毒，結果發現多聚糖包被納米銀比未包被納米銀表現出更強的細胞毒性和遺傳毒性。Nguyen等[11]的研究則表明，用未包被的納米銀(20 nm、40 nm、60 nm、80 nm)染毒鼠巨噬細胞和人結腸上皮細胞比用PVP包被納米銀(10 nm、50 nm、75 nm)和檸檬酸鹽包被納米銀(10 nm、50 nm、75 nm)對細胞活性的抑制作用更大。本研究結果表明，PVP包被的納米銀與無包被的納米銀引起細胞DNA損傷與染色體畸變的程度不同，這可能與2種材料的銀離子釋放量不同有關，因為納米銀的毒性作用可由粒子表面釋放的銀離子引起[12]，而納米銀的表面涂層材料影響Ag+釋放[13]。

圖4 胞質分裂阻滯微核細胞組學試驗細胞分類注：A，雙核正常細胞；B，含有Ⅰ型微核的雙核細胞；C，含有Ⅱ型微核的雙核細胞；D，含有核芽的雙核細胞；E，含有核質橋的雙核細胞。Fig. 4 The cell classification of cytokinesis micronuclear test cellsNote: A, double nucleus normal cell; B, cells containingⅠmicrokernel dual-core; C, cells containingⅡmicrokernel dual-core; D, binuclear cells containing nuclear sprouts; E, a dual-core cell containing a nuclear bridge.

表3 不同特性納米銀染毒HepG2細胞微核組學效應Table 3 Micronucleus effect of HepG2 cells exposed to nano silver with different properties

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。Note：Compared with the blank control group,aP<0.05，bP<0.01.

本研究采用凋亡實驗、彗星實驗和胞質分裂阻滯微核細胞組學試驗結合，從多遺傳終點和遺傳毒作用機制角度出發，通過分析、比較2種不同納米銀的遺傳作用特征，從體外角度較全面地分析納米銀遺傳毒性的劑量-效應關系。在進行彗星實驗之前，對細胞樣本進行“活力檢查”是很常見的，最常見的試驗是臺盼藍排斥試驗。而彗星實驗針對細胞核，而非細胞，細胞被檢測方法判定死亡不一定核就不完整(例如離心造成的細胞膜破裂，而臺盼藍染料能進入膜破裂的細胞，使細胞染色)，在這種情況下細胞活力不是一個有意義的概念，且Hoechst 33258對細胞核染色清晰，不僅能測定凋亡率，而且可以清楚地觀察到核形態，所以，在評價遺傳毒性前，先用Hoechst 33258熒光染色法評價納米銀對HepG2細胞核形態與凋亡率的影響。

彗星實驗結果表明，2種納米銀均會引起DNA損傷，這與很多研究結果類似[14-15]，如用PVP包被納米銀處理宮頸癌(Hela)、乳腺癌(MDA-MB-231和MCF-7)細胞12或24 h，彗星實驗結果均顯示出嚴重的DNA損傷[16]。同樣，在本研究的胞質分裂阻滯微核細胞組學試驗中，除核質橋及核芽外，2種納米銀引起的染色體畸變各效應指標均呈隨染毒濃度增高而增高的趨勢，表明納米銀對HepG2細胞染色體丟失、染色體斷裂、基因擴增與基因量改變等遺傳毒性效應呈濃度相關性。Sahu等[17]在肝癌細胞HepG2細胞和Caco細胞中，在0.5至15 μg·mL-1的濃度范圍內納米銀誘導具有微核的雙核細胞頻率以濃度和時間依賴性的方式增加。Papageorgiou等[18]的研究表明，隨著納米銀濃度的增加，MCF-7細胞和HepG2細胞的有絲分裂指數隨之下降，濃度越大有絲分裂指數越小，并觀察到不同類型的染色體畸變。

綜上所述，納米銀對HepG2細胞可產生DNA損傷、染色體畸變等遺傳毒性效應，無包被納米銀比PVP包被納米銀更容易引起DNA損傷，PVP包被納米銀比無包被納米銀更容易引起細胞染色體畸變相關效應，且損傷程度與濃度相關，濃度越高遺傳損傷越嚴重。本研究通過彗星實驗與胞質分裂阻滯微核細胞組學試驗相結合探討不同包被納米銀的體外遺傳毒性差異，為納米銀的體外遺傳毒性評估提供參考依據。