細顆粒物(PM2.5)主要組分模擬溶液對發光細菌的光抑制分析

孫成華，劉保獻，鹿海峰，張大偉,*，洪姍姍，劉康，常淼，杜澤瑞

1. 北京市環境保護監測中心，北京 100048 2. 大氣顆粒物監測技術北京市重點實驗室，北京 100048

大氣污染與健康的關系越來越受到人們的關注，眾多的研究表明，顆粒物的濃度與人群死亡率和肺癌發病率增加顯著相關。《全球疾病負擔2013研究》報告顯示[1]：空氣污染已成為2013年影響中國人健康的三大風險因素之一。研究發現，顆粒物短期或長期暴露均會對人體產生不良的健康效應[2-10]，主要包括：致使重病和慢性病患者的死亡率升高；使肺功能和免疫功能下降，造成呼吸系統和心腦血管系統疾病惡化；增加惡性腫瘤的患病率等。顆粒物對生物體的毒性效應已經成為近年來的研究熱點。顆粒物的健康效應不僅來自其物理性質，其復雜的化學組成也是健康效應的影響因素[4, 6]。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

MicroTox稀釋液，MicroTox滲透壓調節液，MicroTox補充液，實驗用小玻璃試管，費氏弧菌凍干粉(批號16C4029，17B4040)(美國Modern Water公司)。10～100 μL可調節取樣槍，100～1 000 μL可調節取樣槍(吉爾森)。硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨、七水硫酸鋅(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。硝酸鉛(分析純，天津市福晨化工廠)。

Microtox Model 500毒性檢測系統(美國Modern Water公司)，儀器配備了30孔溫控培養室，溫度控制在(15±0.5) ℃；恒溫調節溫控菌種培養槽，溫度控制在(5.5±1) ℃；實驗樣品測試井，溫度控制于(15±1.0) ℃。AD-2100F連續測定pH計(上海儀樂)。

1.2 方法

1.2.1 模擬溶液配制方法

分析2014—2015年PM2.5組分濃度與發光抑制率的關系，發現樣品提取液發光抑制率值均與Pb、Zn、Cu、Mn相關性較強，Cu、Mn的鹽溶液有顏色會干擾發光細菌發光測試結果，本實驗選擇Pb、Zn開展發光細菌發光抑制測試。Charrier等[19]研究發現，顆粒物中大部分金屬以可溶性的離子態形式存在，因此選用發光細菌光抑制測試實驗中常用標準參照物硫酸鋅和易溶的硝酸鉛配制模擬溶液；鋅、鉛等元素在PM2.5中含量較低，其當量濃度比硝酸根、硫酸根當量濃度低近千倍，在模擬硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨溶液中加入硫酸鋅、硝酸鉛對溶液中硫酸根和硝酸根的濃度影響極低。參照2014—2015年Pb、Zn在不同濃度級別顆粒物樣品中的平均濃度(表1)，估算了不同級別PM2.5提取液中的硫酸鋅、硝酸鉛濃度，分別模擬配制硫酸鋅、硝酸鉛、硫酸鋅和硝酸鉛的混合溶液以及不同濃度級別硫酸鋅、硝酸鉛與硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨的混合溶液。

1.2.2 模擬溶液pH值測試

1.2.3 發光細菌光抑制測試方法及質量控制

采用Model 500毒性檢測系統，按照標準方法(ISO11348-3：2007，水樣對費氏弧菌發光抑制效應的測試-使用凍干細菌的方法)，實驗步驟參見文獻[11,14]。測試質控措施：菌種復蘇后，應用ATP模式測試實驗用菌液初始發光值，實驗用菌液初始光子計數值要大于107。每批次樣品測定時，同步測試菌種稀釋液(空白)、相同濃度標準毒性參照物溶液(質控樣)的發光抑制率，以控制菌液質量；同步測試溶液配制用水的發光抑制率作為背景參考值，每個濃度溶液平行測定2～3次，結果取各次測試的平均值。全部實驗過程中共測試菌種稀釋液空白14個，發光抑制率平均值為-3.14%±1.78%，配制用水空白8個，發光抑制率平均值為-1.71%±2.62%，標準毒性參照溶液(10 mg·L-1硫酸鋅)14個，發光抑制率平均值為87.0%±1.46%。

1.2.4 聯合影響效應測試混合溶液的配制及聯合影響效應判定方法

混合物的配比不同對聯合影響效應判定的實驗結果有影響[20]，因此混合硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨的溶液中，各組分濃度比例參照2014—2015年各組分在日均值6級顆粒物樣品中的平均濃度進行估算，混合硫酸鋅、硝酸鉛的比例參照2014—2015年6級顆粒物樣品中Pb、Zn的平均濃度比例估算。

參考硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨混合溶液的EC50值和硫酸鋅、硝酸鉛混合溶液的EC50值，配制等毒性比硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨與硫酸鋅、硝酸鉛的多元混合溶液。

多種污染物與生物體的聯合毒性作用，可以分為獨立、相加、協同和拮抗4種作用類型，采用毒性單位法(TU)、相加指數法(AI)、混合毒性指數法(MTI)等方法可對這些類型進行定量判別和分析[20-23]。

毒性單位法中規定混合物中第i組分的毒性單位為:

式中Ci為混合物在半數抑制效應時第i組分的濃度，EC50i為化合物單獨作用時的半數抑制效應濃度。混合物的毒性單位等于各組分的毒性單位之和：

M=TUmix=∑TUi

若令M0=M÷max(TUi)，依據M0結果可以評價混合物的聯合作用類型，表1為聯合毒性作用類型量化評價依據。

相加指數法是在毒性單位法基礎上發展起來的，定義如下：

當M>1時，AI=M(-1)+1.0

混合毒性指數法定義為：

M0=M÷max(TUi)

2 結果與分析 (Results and analysis)

2.1 硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨等模擬溶液濃度的確定

2014—2015年分別測試3～6級PM2.5樣品提取液129、69、57、39份，統計各級別PM2.5樣本組分濃度(表2)，估算3～6級PM2.5樣本提取液中各組分平均濃度，轉換成當量濃度后估算3～6級各模擬溶液濃度分別為：硫酸氨溶液(7.17、10.7、12.0、13.5 μg·mL-1)，硝酸氨溶液(10.6、14.6、25.6、36.1 μg·mL-1)，硫酸氫氨溶液(3.88、2.47、6.28、13.2 μg·mL-1)，七水硫酸鋅溶液(0.539、0.718、0.951、1.28 μg·mL-1)，硝酸鉛溶液(0.088、0.123、0.157、0.219 μg·mL-1)，此外還選擇2014—2015年Zn、Pb的最高濃度估算配制了樣品最高濃度的七水硫酸鋅模擬溶液(2.83 μg·mL-1)，硝酸鉛模擬溶液(0.457 μg·mL-1)。

表1 不同評價指數的聯合作用類型判斷標準Table 1 The joint toxicity types and standards of different evaluating methods

表2 不同濃度級別顆粒物樣品中硫酸根、硝酸根、氨離子、鋅、鉛平均濃度(μg·m-3)Table 2 The average concentration of major compositions of PM2.5(μg·m-3)

注：PM2.5濃度分級參考標準HJ633—2012。Note: The classification of daily average level of PM2.5refer to Standard HJ633-2012.

2.2 不同濃度級別硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨等模擬溶液對發光細菌的光抑制測試結果

圖1為不同濃度硫酸氨、硝酸氨及其混合溶液對發光細菌發光抑制的測試結果，圖2為不同濃度硫酸氫氨及其與硫酸氨、硝酸氨混合溶液對發光細菌的光抑制的測試結果。3～6級硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨溶液及它們的混合溶液均未對發光細菌的發光產生抑制，當硫酸氨和硝酸氨濃度為6級濃度的1 000倍時，對發光細菌的發光抑制率平均值分別為69.2%和37.0%。配制硫酸氨、硝酸氨濃溶液，選擇5個合適的稀釋濃度，測試各濃度溶液發光抑制率，繪制曲線，計算得到硫酸氨、硝酸氨EC50值分別為2.31×104μg·mL-1、2.75×104μg·mL-1。

圖1 不同濃度硫酸氨、硝酸氨及其混合模擬溶液對發光細菌的發光抑制率Fig. 1 Luminous inhibition rate of different concentrations of ammonium sulfate, ammonium nitrate and their mixed solution

圖2 不同濃度硫酸氫氨及其混合模擬溶液對發光細菌的發光抑制率Fig. 2 Luminous inhibition rate of different concentrations of ammonium hydrogen sulfate and ammonium hydrogen sulfate mixed with ammonium sulfate, ammonium nitrate solution

在估算硫酸鹽和硝酸鹽濃度時，發現隨著PM2.5濃度增加，氨離子和硫酸根及硝酸根之間的當量濃度差距加大(圖3)，模擬各級溶液時選擇H+平衡陰陽離子之間的差異，硫酸氫氨溶液偏酸性，硫酸氫氨濃度為6級估算濃度的10倍(132 μg·mL-1)時，pH值為3.23，對發光細菌發光顯著抑制(發光抑制率為99.9%)。將10倍的6級硫酸氫氨模擬溶液逐級稀釋，測試稀釋溶液的發光抑制率，繪制的曲線見圖4。由曲線可以觀察到，當H+濃度增加到6級細顆粒物(PM2.5)提取液中硫酸氫氨濃度的5倍時，模擬混合溶液即開始對發光細菌的發光產生明顯抑制(圖2)，發光抑制率與硫酸氫氨的稀釋濃度指數相關(圖4), 硫酸氫氨EC50值為79.8 μg·mL-1。同時將10倍的6級硫酸氫氨與硫酸氨、硝酸氨各模擬混合溶液逐級稀釋，測試發光抑制率，混合溶液發光抑制率均與稀釋濃度指數相關(圖2，圖4)，計算硫酸氫氨及混合溶液的EC50值，采用毒性單位法(TU)、相加指數法(AI)、混合毒性指數法(MTI)等聯合影響效應評價方法，計算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等參數(表3)，其中M≈1≈M0，AI=0，MTI=0，各混合溶液對發光細菌的光抑制均為硫酸氫氨的獨立作用，說明硫酸氫氨與硫酸氨、硝酸氨混合鹽溶液中對發光細菌光抑制的主要影響因素是H+。

圖3 不同濃度級別PM2.5中氨離子當量濃度與硫酸根和硝酸根當量濃度比較Fig. 3 The equivalent concentration of ammonia ion compared to the equivalent concentration of sulfate ion and nitrate ion in PM2.5 samples

圖4 10倍6級硫酸氫氨模擬溶液對發光細菌的光抑制的稀釋濃度曲線Fig. 4 The correlation curve of luminous inhibition rate and diluted concentration of ammonium hydrogen sulfate

模擬溶液中應用氫離子平衡陰陽離子濃度，降低了溶液的pH值，但實際PM2.5樣品提取液中鈉、鉀、鈣、鎂等離子同時參與陰陽離子平衡[17,24]，2014年6級PM2.5樣品的提取液pH平均值為5.35，高于6級模擬溶液pH值(4.55)，模擬實驗中H+對發光細菌的影響會比實際PM2.5樣品提取液高。楊懂艷等[25]測試了2012年8月—2013年7月一年的PM2.5水溶性離子濃度，統計發現陰陽離子年均比值為1.12，水溶性離子總體偏酸性，實際PM2.5樣品提取液中，H+對生物的影響效應仍需重視，應加大力度控制硫酸根、硝酸根、氨離子等前體物的排放量，重視對PM2.5中水溶性離子陰陽平衡的分析。

2.3 不同濃度級別鋅、鉛等模擬溶液對發光細菌的光抑制測試結果

由圖5，6可見，5級以下硫酸鋅、硝酸鉛溶液及其混合溶液均未顯著抑制發光細菌發光，模擬硫酸鋅溶液對發光細菌發光抑制的影響要高于硝酸鉛，鋅離子對發光抑制的無效應濃度為0.19 μg·mL-1、鉛離子對發光抑制的無效應濃度為0.44 μg·mL-1。3～6級模擬硝酸鉛溶液中，鉛離子的濃度均低于其無效應濃度(0.44 μg·mL-1)，而5級以上模擬硫酸鋅溶液中，鋅離子濃度則高于其無效應濃度(0.19 μg·mL-1)。

圖5 不同濃度硫酸鋅溶液對發光細菌的光抑制測試結果Fig. 5 Luminous inhibition rate of different concentrations of zinc sulfate solution

表3 混合體系的 EC50值和聯合毒性評價參數及作用類型Table 3 Joint toxicity evaluating parameters and types for different multi-mixture systems

圖6 不同濃度硝酸鉛溶液對發光細菌的光抑制測試結果Fig. 6 Luminous inhibition rate of different concentration of lead nitrate solution

由硫酸鋅、硝酸鉛的EC50曲線估算，硫酸鋅、硝酸鉛EC50值分別為4.45 μg·mL-1、1.80 μg·mL-1。參照2014—2015年6級顆粒物樣品中Pb、Zn的平均濃度比例配制硫酸鋅與硝酸鉛混合溶液，選擇5個合適的稀釋濃度，測試發光抑制率，計算得到混合溶液的EC50值為2.87 μg·mL-1，采用毒性單位法(TU)、相加指數法(AI)、混合毒性指數法(MTI)等聯合影響效應評價方法，計算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等參數(表3)，其中M<1，AI>0，MTI >1，硫酸鋅和硝酸鉛混合溶液中，鋅和鉛對發光細菌的聯合影響效應表現為協同。王瑩等[26]測試了Zn2+、Pb2+對水螅的聯合毒性作用，王銀秋等[27]測試了Zn2+、Pb2+對鯽魚和泥鰍的聯合毒性作用，發現Zn2+、Pb2+對這些水生生物的聯合毒性多表現為拮抗作用，這種差異可能緣于不同實驗物種對不同金屬的敏感性不一致。高繼軍等[28]在應用淡水發光菌研究二元重金屬混合物的聯合毒性時注意到：應用不同的測試生物對相同的重金屬混合物進行測試，會出現不同的作用方式。。孟慶俊等[20]在研究苯胺與甲基苯胺對大型溞的聯合毒性時發現:混合物的配比不同得到的聯合毒性作用結果不同，本次實驗Zn2+、Pb2+的混合溶液配制比例按照實際PM2.5中Zn2+與Pb2+的濃度比例配制，而王瑩等[26]的試驗中Zn2+、Pb2+的混合溶液按等毒性比例配制。

2.4 硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨與硫酸鋅、硝酸鉛混合溶液對發光細菌的光抑制

參照硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨混合溶液的EC50值以及硫酸鋅、硝酸鉛混合溶液的EC50值，配制硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨與硫酸鋅、硝酸鉛等毒性比的混合溶液。選擇5個合適的稀釋濃度，測試發光抑制率，計算得到混合溶液的EC50值為63.6 μg·mL-1，采用毒性單位法(TU)、相加指數法(AI)、混合毒性指數法(MTI)等聯合毒性評價方法，計算各混合溶液的TU、M、M0、AI、MTI等參數(表3)，其中M<1，AI>0，MTI >1，多元混合體系對發光細菌的影響呈現協同作用。圖7中5級以上硫酸鋅、硝酸鉛模擬溶液和相同級別硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨溶液混合后，發光抑制率值顯著增加，表明硫酸鹽、硝酸鹽與鋅、鉛的混合體系呈現協同作用。

3 討論與結論(Discussion and conclusion)

模擬的PM2.5主要組分溶液對發光細菌的光抑制測試實驗表明：(1)與3～6級PM2.5可溶性提取液中硫酸氨、硫酸氫氨、硝酸氨、硫酸鋅和硝酸鉛濃度相同的模擬溶液對發光細菌的發光沒有抑制作用。(2)硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨混合溶液中，對發光細菌的光抑制均為硫酸氫氨的獨立作用，硫酸鋅與硝酸鉛的混合體系，鋅和鉛對發光細菌的聯合影響效應表現為協同，硫酸氨、硝酸氨、硫酸氫氨與硫酸鋅、硝酸鉛的多元混合體系呈現協同作用。

圖7 3～6級鋅、鉛等模擬溶液對發光細菌的光抑制測試結果Fig. 7 Luminous inhibition rate of different concentrations of lead and zinc salt solution, lead and zinc salt solution mixed with ammonium hydrogen sulfate, ammonium sulfate and ammonium nitrate solution

目前，我國尚沒有開展顆粒物組分與健康效應關聯的長期流行病學調查，顆粒物組分健康效應的毒理學實驗也開展較少，Liu等[29]春季在北京城區和郊區開展了PM2.5樣品組分分析和顆粒物提取液DTT氧化損失能力測試，應用2種細胞系開展了體外毒性測試，評估并解析了顆粒物不同來源組分與活性氧產生能力的關系，發現二次來源的顆粒組分、Zn、Al、Pb、Fe和沙塵源顆粒組分是引起細胞氧化損傷和產生炎性因子重要因素。Wang等[30]研究了北京不同粒徑的顆粒物電位、比表面積以及可溶性有機物、過渡金屬、多環芳烴、內毒素等組分濃度特點，并應用DTT氧化損失能力測試方法分析了不同粒徑顆粒物的氧化應激能力，采用人肺癌細胞系A549和小鼠單核巨嗜細胞系，測試了這些顆粒物對細胞活力的影響以及在顆粒物作用下肺癌細胞系A549的白細胞介素-8和巨嗜細胞腫瘤壞死因子-α的產生情況，分析了粒徑、組分濃度與氧化應激和細胞毒性因子的相關性。但各組分之間的聯合影響效應研究尚不多見。雖然PM2.5提取液的發光細菌的發光抑制實驗可以實現測試程序標準化，能夠簡單、快速得出測試結果，但發光細菌細胞與高等動物及人體細胞相比，結構簡單，缺少遺傳毒性、免疫毒性等靶標，且顆粒物暴露方式與高等動物及人體細胞相比有一定的差異，發光抑制測試結果只能預警提示PM2.5對健康可能存在危害。本研究僅針對PM2.5金屬組分與硫酸鹽、硝酸鹽組分對生物的聯合影響開展了初步研究，這些組分與PM2.5中主要有機組分OC(占比27%～30%)之間的聯合影響效應還有待進一步探討。為科學研究顆粒物不同組分對生物及人體影響，評估顆粒物的健康效應，應建立起不同種群多種模式生物[10,30-33]顆粒物毒性評估監測體系，為大氣污染治理提供參考。