肺癌患者血清特異性核酸適配體的篩選及鑒定

邸 婭，趙運旺，盧坤玲，何 雷，徐 歡，鄭 岳

1秦皇島市第一醫院，河北 秦皇島 066000；2燕山大學環境與化學工程學院，河北 秦皇島 066004

肺癌患者的5年生存率極低，僅有5%～10%[1]。早期診斷和早期治療是提高肺癌生存率的關鍵。目前，臨床上采用肺癌血清腫瘤標志物聯合檢測的診斷手段，提高了肺癌診斷的準確性和靈敏度[2]。最常見的肺癌血清腫瘤標志物有：神經元特異性烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原（CEA）、細胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、胃泌素釋放肽前體（ProGRP）、鱗狀細胞癌相關抗原（SCC-Ag）等[3]。血清中蘊藏著豐富的與疾病早期診斷相關的組織學信息，血清中包含有白蛋白、免疫球蛋白、轉鐵蛋白、脂蛋白等高豐度蛋白。小分子量蛋白質組學研究的對象包含有幾類重要生理學功能的蛋白，像細胞因子類、炎癥趨化因子類、多肽類激素，另外還有大分子量蛋白的酶切片段和大量的腫瘤標志物，它們與疾病的發生發展關系密切[4-6]。

核酸適配體（Aptamer）是一種具有高親和力、強特異性的識別目標靶分子的ssDNA或RNA[7]，其作用的靶標分子范圍比較廣泛，無免疫原性，穩定性好且易于修飾等，因而可以代替抗體用于臨床檢測和治療。Aptamer的篩選主要依賴于SELEX技術，SELEX技術自創立以來發展迅速，已在生物學和基礎醫學研究、臨床檢測和診斷以及藥物開發和疾病治療等領域得到廣泛應用[8-10]。本實驗采取的消減SELEX技術是一種新型的改良SELEX技術，其主要原理為SELEX篩選時去除與非特異靶標分子結合的ssDNA，然后將消減后的次級ssDNA文庫作為目標靶分子結合的文庫進行篩選。

另外，本研究采用的磁珠是目前一種新型的篩選介質，它是對磁珠進行一定的表征，使表面賦予新的官能團即-COOH，作為一種陰離子交換基團，與表面帶正電荷的靶蛋白偶聯，用于研究靶蛋白與DNA結合的特性。與普通磁性材料相比，具有較強的超順磁性，并且修飾過的磁珠具有良好的生物相容性，易于吸附蛋白。有研究通過瓊脂糖消減SELEX技術篩選得到癌胚抗原特異性單克隆抗體（Anti-CEA）核酸適配體[11]。本研究首次以肺癌血清為篩選靶標，正常血清為反篩選靶標，通過消減SELEX技術篩選得到高特異性、強親和力的肺癌血清aptamers，可特異識別肺癌血清，為肺癌的早期診斷和早期治療提供新的分子生物學檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

磁珠：上海西寶生物科技有限公司；隨機ssDNA文庫（88 nt，1.2 nmol/L）：5′-CTATAGCAATGG TACGGTACTTCC（40 N）CAAAAGTGCACGCTACT TTGCTAA-3′（N=A、G、T、C）；引物P9：5′-CTATAG CAATGGTACGGTACTTCC-3′；引物P12：5′-TTA GCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′。引物P12（biotin）：5 ′biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3 ′均由上海生工合成。

肺癌病人血清由秦皇島市第一醫院提供；正常人血清由秦皇島市第一醫院提供。1×Binding buffer（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 6.5 mmol/L Na2HPO4, 1.8 mmol/L NaH2PO4, 2.5 mmol/L MgCl2,1 mmol/L CaCl2）。結合緩沖液：20 mmol/L HEPES，pH=7.35， 120 mmol/L KCl， 1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2；篩選緩沖液：20 mmol/L HEPES，pH=7.35， 120 mmol/L KCl， 1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2+0.05%-2%Tween20。

1.2 方法

1.2.1 血樣的預處理 收集100個肺癌病人全血，在室溫下3 000 r/min離心10 min去除血細胞，收集血清；然后在4 ℃條件下，15 000×g，離心30 min，除沉淀和表面油脂，收集中層清液，置–80 ℃保存待用。正常人血清的處理同上。

1.2.2 混合血清的配置 將收集到的100例肺癌血清各取50 μL混勻，制備成肺癌混合血清（消除患者之間的異質性），50 μL/管分裝，–20 ℃冰箱保存備用。以同樣的方法制備正常混合血清，分裝后–80 ℃凍存備用。以同樣的方法制備正常混合血清，分裝后凍存備用。

1.2.3 正常混合血清消減SELEX篩選 取2.5 nmol/L的文庫，95 ℃加熱5 min，然后立即放在冰上，約20 min可以與靶標分子結合，不用時最好4 ℃條件保存，使ssDNA能形成穩定的天然構象。

取1 mL羧基化瓊脂磁珠，結合600 μL正常混合血清，37 ℃，孵育2 h，棄去EP管中的正常混合血清，加入10 μmol/L tRNA，37 ℃，孵育30 min，（tRNA非特異性競爭劑進行篩選，增加篩選的特異性）, 用篩選緩沖液洗2次，1 min/次，再用結合緩沖液洗1次，1 min，結合初級ssDNA文庫（95 ℃ 5 min, 4 ℃ 10 min, 37 ℃5 min，ssDNA），37 ℃，孵育1 h。棄去未結合ssDNA文庫，用篩選緩沖液洗3次，1 min/次，加入200 μL去離子水，95 ℃，10 min，收集上清，作為下一輪篩選的次級庫。重復上述步驟進行下一輪篩選，共進行3輪消減SELEX篩選。

1.2.4 實時定量-PCR擴增獲得dsDNA dsDNA反應體系包括上游引物P9（25 pmol/μL）0.8 μL，下游引物Bio-P12（25 pmol/μL）0.8 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）8 μL，10×buffer 10 μL，熒光染料（super greenⅠ）2 μL，模板DNA 160 μL，rTaqDNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，去離子水57.4 μL，充分混用，30 μL/管，分成8管，實時定量-PCR進行擴增[12]。S型曲線達到最高點停止擴增。

1.2.5 鏈霉親和素磁珠分離次級ssDNA文庫 取0.2 mL瓊脂磁珠，加入500 μL 1×10–4g/L鏈霉親和素，37 ℃，孵育2 h。加入200 μL經實時定量-PCR擴增后的PCR產物，37 ℃孵育30 min，棄去上清，用1 mL 1%Tween-20的PBS，40 ℃水浴5 min，重復3次，加入200 μL 1×Binding buffer ，95 ℃ 5 min，磁分離收集上清，作為下一輪篩選的次級ssDNA庫。

1.2.6 反篩選 取0.3 mL磁珠于1.5 mL EP管中，偶聯200 μL肺癌混合血清，作為正篩管，37 ℃，孵育2 h；取等量的磁珠于1.5 mL EP管中，偶聯200 μL正常混合血清，作為反篩管，37 ℃，孵育2 h。棄去正篩管、反篩管中的血清，加入10 μmol/L tRNA，37 ℃，孵育30 min, 用篩選緩沖液洗2次，1 min/次，再用結合緩沖液洗1次，1 min/次，結合次級ssDNA文庫（95 ℃5 min, 4 ℃ 10 min, 37 ℃ 5 min，ssDNA）, 37 ℃，孵育1 h。棄去未結合ssDNA文庫，用篩選緩沖液洗3次，1 min/次，加入200 μL去離子水，95 ℃ 10 min，收集上清，作為下一輪篩選的次級庫，重復上述篩選步驟。

1.2.7 重復篩選及篩選壓力 重復上述的反篩、正篩、實時定量-PCR擴增、鏈霉親和素磁珠法分離次級ssDNA文庫等步驟，直至篩選文庫與靶蛋白分子的結合達到飽和。在整個篩選過程中隨著篩選輪數的增加，投入的ssDNA文庫的量逐漸減少，而且不斷的增加篩選的壓力，比如逐漸減少磁珠的用量，減少孵育時間，提高ssDNA文庫/磁珠結合血清比例。

1.2.8 次級核酸適配體庫擴增獲得dsDNA 將篩選得到的第9輪次級ssDNA庫，通過實時定量-PCR擴增，擴增至S型曲線最高點停止擴增。

1.2.9 肺癌血清核酸適配體同源性分析 將上海生工生物高通量宏基因組微生物測序結果用DNAMAN軟件進行同源性分析。挑選出高豐度的核酸適配體序列送上海生工合成。

1.2.10 肺癌血清核酸適配體Kd值的測定 將獲得的10條核酸適配體序列送上海生工進行合成，而且將所有序列的5′端標記帶有生物素。依照SELEX篩選的過程設置磁珠-肺癌血清復合物組和磁珠-正常人血清復合物組，分別投入等量的標記后的ssDNA，37 ℃孵 育 1 h， 然 后 加 入 1∶2000 稀 釋 的 HRP-labeled Streptavidin，37 ℃孵育30 min，最后加入TMB顯色液200 μL，37 ℃避光顯色15 min，2 mol/L硫酸50 μL終止反應，酶標儀測定A450 nm值。

1.2.11 肺癌血清核酸適配體特異性鑒定 經肺癌血清核酸適配體親和力測定分析，Seq-2、Seq-3、Seq-6、Seq-19序列親和力最強，送上海生工進行合成。取0.1 mL磁珠于1.5 mL EP管中，標記為“1+”，偶聯50 μL肺癌病人血清，37 ℃，孵育1 h；取0.1 mL磁珠于1.5 mL EP管中，標記為“1-”，偶聯50 μL正常人血清，37 ℃，孵育1 h；棄去上述載體中的血清，用篩選緩沖液洗3遍，1 min/次，“1+”、“1-”EP管各結合100 μL篩選得到的肺癌血清核酸適配體（95 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min），37 ℃，孵育30 min，用1 % tween+PBS洗3遍，加100 μL純水，95 ℃ 10 min，收集上清，實時定量-PCR檢測。收集的200份肺癌血清和200份正常人血清按上述步驟進行特異性鑒定。

1.2.12 肺癌血清核酸適配體二級結構模擬分析 將篩選得到的肺癌血清核酸適配體序列，采用DNAMAN軟件，依據DNA最低自由能的運算法則，進行核酸適配體二級結構預測和結構分析。

2 結果

2.1 肺癌混合血清復合靶SELEX篩選結果

2.1.1 肺癌混合血清復合靶SELEX篩選條件 共進行了9輪篩選，各輪篩選條件如表1。隨著SELEX篩選輪數增多，篩選條件越來越苛刻，文庫/磁珠結合血清比例不斷提高，孵育時間不短縮短。消減SELEX的基本原理是從數量巨大的人工合成的隨機ssDNA文庫中，通過多輪循環篩選和擴增，最終篩選得到與特定靶分子特異性結合的核酸適配體。而與靶分子特異性結合的核酸適配體是受篩選條件驅動的，比如磁珠的用量，孵育時間，洗脫力度等，尤其是靶分子與ssDNA文庫的比列，隨著篩選輪數的增加，篩選條件是逐步趨于苛刻的。

表1 肺癌血清核酸適配體SELEX篩選條件

2.1.2 肺癌混合血清與ssDNA文庫結合狀況 以肺癌混合血清為靶標進行消減SELEX篩選過程中，隨著篩選輪數的增加，ssDNA文庫與肺癌混合血清的結合不斷增多，表明能與肺癌血清結合的特異性核酸適配體不斷被富集。至第9輪，ssDNA文庫與肺癌血清的結合已經達到飽和，故而終止篩選（圖1）。整個篩選過程用實時定量-PCR進行動態檢測。

圖1 實時定量-PCR檢測肺癌血清核酸適配體富集結果

2.2 肺癌血清核酸適配體的Kd值

采用SELEX技術進行循環篩選，利用生物素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統檢測篩選得到的10條肺癌血清核酸適配體與肺癌血清的親和力。結果顯示，Seq-2、Seq-3、Seq-6、Seq-19序列的親和力較強，其中Seq-19序列的親和力最強。

2.3 肺癌血清核酸適配體高通量測序結果

經過9輪篩選得到10個肺癌血清適配體序列（表2）。

表2 肺癌血清核酸適配體序列

圖2 肺癌血清核酸適配體親和力檢測結果

2.4 肺癌血清核酸適配體同源性及進化樹分析結果

高通量測序后，利用DNAMAN軟件對10條肺癌血清核酸適配體進行多序列比對和同源性分析。如表2所示，測序結果與預期長度一致，其同源性達66.98%。獲得的核酸適配體富含G、C序列，且同源性較高。另外結合進化樹分析，獲得的核酸適配體按照同源性主要分為3個家族F1、F2和F3（圖3）。

圖3 肺癌血清核酸適配體同源性及進化樹分析結果

2.5 肺癌血清核酸適配體二級結構預測

用DNAMAN軟件預測篩選到的肺癌血清核酸適配體的二級結構。顯示核酸適配體有豐富的二級結構。主要以莖環結構（Loop-stem）、莖凸環結構（bulge）為主。

2.6 肺癌血清核酸適配體特異性鑒定結果

200份肺癌血清、200份正常人血清分別與4條肺癌血清核酸適配體的特異性鑒定結果如圖5，與肺癌血清孵育后結合的ssDNA的Ct值與正常人血清孵育后結合的ssDNA的Ct值的差值，即ΔCt值，鑒定結果表明4條肺癌血清核酸適配體的ΔCt值都在4～5個循環左右，說明我們成功篩選得到高特異性、強親和力的肺癌血清核酸適配體。

圖4 部分肺癌血清核酸適配體二級結構預測圖

圖5 肺癌血清核酸適配體特異性鑒定結果

3 討論

自1990年SELEX技術首次建立以來，該技術得到不斷豐富和發展，在各研究領域也顯示出良好的應用前景[16-18]。近年來在經典SELEX技術基礎上，發展了多種SELEX新技術，如復合靶SELEX，消減SELEX，細胞SELEX等[13-15]。復合靶SELEX技術可以篩選出完整細胞復合靶標中多種分子的特異性核酸適配體[19-20]，并且相互不干擾；消減SELEX技術可將兩個同源的符合靶標中共同分子的核酸適配體分子先進行消減，進而高效獲得差異靶分子的特異性核酸適配體。

SELEX篩選所用的隨機寡核苷酸文庫常用的有ssDNA文庫和RNA文庫。ssDNA文庫穩定性好，易變性和復性，可長期保存。RNA文庫空間結構豐富，與不同靶分子結合的特異性更強，但易受RNA酶降解[21-23]。血清中含有大量的RNA酶，所以限制了RNA文庫在血清核酸適配體篩選中的應用。

利用消減SELEX技術篩選核酸適配體的方法，采用（次級）庫結合磁珠，經過孵育、洗滌、洗脫；經過PCR擴增負鏈帶有親合素的dsDNA；磁珠鏈霉親合素制備ssDNA次級庫，同樣經過經過孵育、洗滌、洗脫；實際操作每輪篩選就只有兩次孵育、洗滌、洗脫和一次的PCR，再通過每輪的富集檢測和二代基因高通量測序確認富集程度和準確獲得較全面的富集核酸適配體。其優點是成本較低、操作簡單、快速、準確、全面等，并且能有效的消減血清中高豐度蛋白，去除非特異ssDNA的富集，篩選效率得到有效提高，其篩選得到的核酸適配體具有結構多樣性。本研究采用磁珠鏈霉親和素制單鏈具有效率高，采用PCR方法制備單鏈的復雜繁瑣，以及人為因素的干擾和不確定性。利用基因二代次序技術對次級庫進行測序，能較準確全面得到高效富集核酸適配體，避免了克隆后測序，造成核酸適配體的丟失和不完整。另外，還可以通過篩選得到的高特異性的核酸適配體組直接通過實時熒光定量-PCR檢測待測樣本血清，該實驗過程耗時不足50 min，同時免去傳統檢測ELISA中的反復洗板過程，成為本研究的最大亮點。利用RNAstructure模擬核酸適配體的二級結構，結果顯示核酸適配體主要以莖環和口袋結構為主，提示這可能是核酸適配體與肺癌血清蛋白結合的結構基礎。

血清是體外診斷研究的最佳標本，同時，腫瘤標志物的檢測是臨床上唯一的無創性診斷手段[24-26]。肺癌作為嚴重威脅人類健康及生命的惡性腫瘤之一，受到人們的高度關注，早期診斷和早期治療是提高肺癌患者存活率的關鍵。本研究針對多項肺癌血清腫瘤標志物，通過SELEX技術篩選其aptamers，建立一種利用特異性寡核苷酸適配體組，同時檢測多種肺癌血清腫瘤標志物的分子生物學檢測新技術，從提高診斷的準確度和靈敏度[27]。同時，利用SELEX技術篩選得到未知的肺癌血清腫瘤標志物，最終建立肺癌早期、中期、晚期血清標志物譜庫[26-30]，為肺癌的早期診斷和早期治療提供新的突破口。