黏蛋白-4在膀胱癌中的表達及作用機制

劉 遠，勞輝恒，李宇同

1廣東省開平市中心醫院泌尿外科，廣東 開平 529300；2暨南大學附屬第一醫院泌尿外科，廣東 廣州 510507

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，是男性第4大常見癌癥，在全球排名第9[1-2]。男性比女性膀胱癌發病率要高[3]。確診時，90%的膀胱癌是尿路上皮癌，其余10%多數是鱗狀細胞癌和腺癌[4]。許多危險因素導致膀胱癌的惡性轉化和進展，包括吸煙、大量飲酒和職業暴露于多環芳烴或芳香胺[5]。粘蛋白存在于由腺上皮分泌的粘液中，起著潤滑和保護人體內各種官腔的作用，還參與細胞間的粘附、信號轉導和免疫反應[6-7]。黏蛋白-4（mucin-4）涉及多種人類癌癥，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膽囊癌、唾液腺癌、前列腺癌、膽道癌和卵巢癌等[8-10]。有研究發現mucin-4在膀胱尿路上皮癌組織中表達是增加的[11]，但是關于mucin-4在膀胱癌中的具體作用機制尚未闡明。本研究為探究mucin-4在膀胱癌中的表達及作用機制做了如下探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣東省兩家三甲醫院泌尿外科2016年1月～2017年6月期間收集的膀胱癌標本115例，同時選取距離腫瘤邊緣＞2 cm的癌旁組織作為對照。所有患者已經病理科明確診斷。

納入標準：所有患者符合《2005年歐洲泌尿外科會議膀胱癌診斷治療綱要》[12]。排除標準：嚴重電解質紊亂者；嚴重肝腎功能不全、心功能不全、嚴重感染者；神志不清，無法配合者。所有受試者已獲得知情同意，并已通過醫院倫理會的批準。

1.2 研究方法

1.2.1 收集組織標本 收集手術過程中經病理確診的膀胱癌組織，和距離腫瘤邊緣＞2 cm（鏡下未見癌細胞）的癌旁組織，大小為0.5 cm×0.5 cm，將組織置于裝入凍存管，置于液氮罐中保存。

1.2.2 RNA的提取和mucin-4 mRNA的QRT-PCR測定 采用Trizol（Invitrogen, Life Technologies）法從組織內提取總RNA，然后反轉錄成cDNA（PrimeScript RT Reagent Kit ，Takara）。用 QRT-PCR法（SYBR Premix Ex Taq Kit，Takara， 7500 Real-time PCR system ，Applied Biosystems）測定血清mucin-4 mRNA的表達，用GAPDH作為內參。

使用公式2–ΔΔCt計算mucin-4 mRNA相對表達量。

1.2.3 細胞培養 用含有10%的胎牛血清，1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM培養T24細胞系（膀胱癌細胞系）。根據細胞生長情況每1～3 d更換1次培養基。

1.2.4 Western blot法 從膀胱癌細胞中提取總蛋白。蛋白質通過SDS-PAGE凝膠電泳分層，轉移到硝酸纖維素膜上。 用5%脫脂牛奶封閉30 min后，將膜與抗mucin-4抗體（1:500；Santa Cruz Biotech）在4 ℃孵育過夜，用TBST（Tris緩沖鹽水Tween 20）洗滌3次，與過氧化物酶標記的第二抗體在室溫下孵育1 h，用TBST洗滌3次。該膜用增強的化學發光顯影。結果用圖像站（UVI，Cambridge，UK）拍攝。

1.2.5 RNA干擾實驗 嚴格按照說明書（廣州瑞博siRNA使用說明（2009-08））進行操作。設置mucin-4過表達模型（mucin-4 mimic），空白對照（mucin-4 mimic control）；mucin-4敲除模型（siRNA），空白對照（siRNA control）。分別觀察mucin-4過表達或者敲除時T24細胞增殖和凋亡情況。

1.2.6 細胞增殖和細胞凋亡實驗 采用MTT比色法判斷細胞增殖情況；采用Caspase 3 ELISA試劑盒（R&D, Minneapolis, MN, USA）判斷細胞凋亡情況。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行分析。計量資料采用均數±標準差表示; 計量資料比較用獨立樣本的t檢驗。計數資料采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mucin-4在膀胱癌組織和癌旁組織的表達

膀胱癌組織mucin-4的相對表達水平明顯高于正常膀胱組織，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 mucin-4在膀胱癌組織組織和癌旁組織的表達

2.2 mucin-4的表達水平與膀胱癌臨床相關參數的關系

mucin-4的表達水平與膀胱癌的腫瘤大小、有無淋巴結轉移，以及TNM分期有關（P＜0.05）；腫瘤直徑大于5 cm組mucin-4的表達水平高于腫瘤直徑小于5 cm組；有淋巴結轉移的膀胱癌組mucin-4的表達水平高于無淋巴結轉移的膀胱癌組；Ⅲ+Ⅳ期膀胱癌組mucin-4的表達水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期膀胱癌，差異具有統計學意義（P＜0.05）。mucin-4的表達水平與膀胱癌患者的年齡、性別無關（P＞0.05，表1）。

表1 mucin-4的表達水平與膀胱癌臨床相關參數的關系

2.3 mucin-4過表達或者敲除時T24細胞增殖和凋亡情況

mucin-4過表達時，膀胱癌細胞（T24細胞系）的增殖是增加的，凋亡是減少的；而mucin-4敲除時，膀胱癌細胞（T24細胞系）的增殖是減少的，凋亡是增加的（圖2）。

圖2 mucin-4過表達或者敲除時T24細胞增殖和凋亡情況（×40)

3 討論

全球流行病學調查數據顯示，全世界每年有超過357 000例膀胱癌新發病例和超過130 000例死于膀胱癌的患者，膀胱癌是男性死亡的主要原因之一[13]。在歐洲，2012年新診斷的膀胱癌新發病例為151 797例[14]。在發展中國家，人口老齡化和煙草使用量高使得膀胱癌的發病率顯著高于發達國家[15]。膀胱癌確切的發病機制尚不清楚，有許多國外文獻報道mucin-4參與多種腫瘤的發生發展過程，但是關于mucin-4在膀胱癌中的的作用，國內文獻鮮有報道。

本研究發現，膀胱癌組織mucin-4的相對表達水平明顯高于正常膀胱組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這與Torres等[16]研究結果一致，提示mucin-4可能在膀胱癌的發生發展中起著重要作用。進一步相關分析顯示，mucin-4的表達水平與膀胱癌的腫瘤大小、有無淋巴結轉移以及TNM分期有關（P＜0.05）。細胞實驗結果發現mucin-4可以促進膀胱癌細胞增殖，抑制凋亡。有研究發現，沉默mucin-4的表達導致胰腺腫瘤生長和轉移減少[17]。這與本研究結果相類似。但是Liu等[18]卻發現mucin-4在乳腺腫瘤轉移中上調，但在原發腫瘤中不上調。這可能與不同類型的癌細胞有關。Torres等[16]研究也認為mucin-4對胰腺癌細胞的增殖、分化、以及轉移中起著重要作用。溫雯靜[11]等對78例膀胱尿路上皮癌患者進行研究，也發現mucin-4蛋白在膀胱癌細胞中的陽性率明顯高于膀胱正常黏膜，與患者年齡、性別、腫瘤數目無關。但與溫的研究結果不同，本研究發現mucin-4的表達水平與膀胱癌的腫瘤大小具有相關性。這可能與病例數、腫瘤分期不同有關。另外溫雯靜的研究采用的是免疫組化等方法，與本研究的方法也有所差異。上述原因都可能造成研究結果的不一致。

結合細胞實驗和統計學分析結果，關于mucin-4在膀胱癌中的可能作用機制有如下幾點：mucin-4能破壞腫瘤細胞中可形成粘連的細胞間相互作用[19]。因此，mucin-4可以促使腫瘤細胞從原發腫瘤分離，促進侵襲和轉移。腫瘤細胞中粘附連接和鈣粘蛋白相互作用的破壞消除了這些細胞中的接觸抑制，導致促進細胞增殖的Erk途徑的信號傳導增加。因此，mucin-4可以通過間接或者直接的抗粘附機制來促進腫瘤細胞生長。另一方面，mucin-4還可以促進促凋亡蛋白Bad的磷酸化和失活，促進存活蛋白Bcl-xl的表達，從而進一步促進膀胱癌細胞的增殖，抑制其凋亡[20]。同時，MUC4還可以通過介導ErbB2的酪氨酸發生磷酸化，進而影響細胞的凋亡與分化[21]。

綜上所述，mucin-4在膀胱癌的發生發展中起著重要作用，其表達水平對膀胱癌的嚴重程度及預后情況具有一定的參考價值。本次研究也存在一定的不足之處：樣本量太小，應適當增加樣本量；缺乏體內實驗證據，應完善動物實驗。