BDKRB2+9/-9基因多態性通過TLR-2表達影響膝骨關節炎中的促炎性細胞因子水平

施犇 陳爍 趙建寧

第二軍醫大學南京臨床醫學院 南京總醫院骨科，江蘇 南京 210002

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是會導致關節畸形和殘廢的一種關節原發疾病，每年全世界有數以百萬計的患者罹患這種疾病[1]。OA的主要特征是軟骨的變性和損傷，同時組成關節其他組織包括骨組織、滑膜、半月板以及韌帶也都受到一定影響[2]。OA的發病機制目前尚未完全清楚，但是現有的研究提示滑膜炎癥產生的炎癥介質所導致關節的疼痛和軟骨的退變，可能在OA的發生發展中起著重要的作用[3]。這些炎癥介質包括炎癥細胞因子、金屬蛋白酶、前列腺素E2和一氧化氮等[4-6]。例如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-1β可導致關節軟骨的退化，IL-1β廣泛作為軟骨細胞凋亡誘導劑[7]，以及其他細胞因子IL-6、IL-8在OA的進程中都有重要的作用[8]。此外，炎癥由toll樣受體(toll-like receptor，TLR)-2和TLR-4介導通路可能在OA病理生理學中也發揮重要作用[9]。TLRs不僅可以被外來微生物激活產生免疫應答，也可以結合機體自身產生的一些內源性分子(DAMPs)發生作用，并且可以通過核因子(nuclear factor，NF)-κB途徑激活這些受體，從而產生促炎癥細胞因子[10]。據以往研究，TLR-2和TLR-4在OA損傷的軟骨細胞周圍表達上調[11]。許多促進軟骨分解代謝的蛋白酶和細胞因子都通過以TLR信號的中心的NF-κB途徑進行調節[12]。有研究提示在大鼠OA模型中NF-κB途徑的阻斷可以將滑膜的炎癥和軟骨的損傷降到最低[12-13]。總的來說，這些研究結果表明在OA發生發展中TLRs介導的免疫反應發揮重要的作用。

既往研究還表明，緩激肽(bradykinin，BK)和BDKRB2與OA的病理生理有密切相關[14]。BK是具有血管舒張活性作用的9肽，在OA患者滑膜液中可以檢測到BK，并且檢測到的BK的水平與滑膜炎的嚴重程度相關[15-16]。BDKRB2可以在人體的滑膜組織中或者培養的滑膜細胞中找到[17-19]。長期在緩激肽刺激中培養的滑膜細胞可以發現其釋放的IL-6和IL-8增加[20]。有實驗證實給予特定BDKRB2受體拮抗劑可以減輕大鼠的炎性疼痛[21]。這些發現提示在治療OA過程中BDKRB2的阻斷可能存在一定的潛在價值。

筆者之前的研究已經揭示BDKRB2 +9/-9基因多態性和OA的易感性以及嚴重性之間的關系[22]，然而BDKRB2基因多態性在滑膜炎癥的作用機制仍尚不清楚。本研究探究了在膝OA患者中BDKRB2 +9/-9基因多態性與促炎因子水平之間的關系，發現在這些OA患者中IL-8、IL-6和TNF-α與BDKRB2+9/-9基因多態性相關。此外，通過提取滑膜組織體外培養滑膜細胞進一步實驗得到BDKRB2+9/-9多態性可以通過改變TLR-2表達影響膝骨關節炎中的促炎細胞因子水平。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

總共有156例原發膝關節OA患者以及121名健康志愿者作為對照參與此次研究。診斷膝關節OA的標準是基于美國大學風濕病學標準[23]以及用凱爾格倫-勞倫斯(Kellgren-Lawrence，KL)分級評估膝OA患者的嚴重性。所有研究對象的人口學特征和風險因素通過客觀采集和體格檢查獲得。其他病因引起的OA如炎性疾病(類風濕、自身免疫性疾病、化膿性感染)、創傷性關節炎、關節發育不良等被排除在外。所有對照組無關節炎病史或者關節疾病的相關特征(如關節疼痛、腫脹、活動受限)。試驗對象的臨床特征如年齡、性別、體質量指數(body mass index，BMI)、吸煙狀況、體力勞動情況和家族史以及OA嚴重程度(表1)，BMI>30 kg/m2被定義為肥胖。本研究經南京總醫院倫理審查委員會批準，且所有參與者均知情并簽署了知情同意書。

表1 試驗組和對照組間的人口學特點

注：ns：差異無統計學意義(P>0.05)；*：差異有統計學意義(P<0.05)。

1.2 BDKRB2基因分型

染色體DNA是從試驗對象的外周血液樣本中獲得，其提取用DNA試劑盒(TianGen Biotech，Beijing，China)，樣本的BDKRB2+9/-9多態性測定采用聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)技術[22]。利用正向引物序列5′-TCCAGCTCTGGCTTCTGG-3′和反向引物序列5′-AGTCGCTCCCTGGTACTGC-3′進行擴增得到產物80 bp(-9)或者是89 bp(+9)。擴增的DNA產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用溴乙錠染色并在紫外光等下進行基因型鑒定。

1.3 分離、培養和處理滑膜細胞

滑膜細胞是從實施全膝關節置換手術的膝OA患者滑膜中收集[女性15人，男性5人，平均年齡(70±5)歲]。滑膜細胞通過前用方法進行分離和培養[24]。收集的組織被切成細碎后用1 A型消化酶(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)在37 ℃及5% CO2環境下放置16 h，得到的組織用70 mm的尼龍網進行過濾并洗滌。然后再離心得到的細胞放在含有青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)的基本培養基(DMEN)中并置于37 ℃及5% CO2環境下進行培養，同時加入10%胎牛血清(Sigma-Aldrich)。培養的細胞分成4組，分別加入1 μM B2受體抑制劑MEN16132 (Sigma- Aldrich)，100nM TLR-2 siRNA(Santa Cruz，CA)，100 nM scrambled siRNA (Santa Cruz，CA)，第4組為對照組，4組分別在有BK刺激(1 μM)和正常培養的情況下培養1 h。24 h后測定培養基質中相關促炎性細胞因子的水平。

1.4 酶聯免疫吸附測定(ELISA)

血清、滑膜液以及培養基質中的炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的測定用ELISA試劑盒(Minneapolis，MN，USA)根據產品說明書進行使用，并在吸光度為450 nm下用酶標儀(Bio-Rad，Richmond，CA)記錄。實驗樣品中細胞因子的濃度用同一個標準曲線進行計算。

1.5 實時定量PCR

RNA用TRIzol試劑(Grand Island，NY，USA)從OA滑膜組織提取并使用第一鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen，Grand Island NY，USA)合成cDNA。基因表達是由實時定量PCR來檢測，使用的是SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA，USA)。PCR反應用ABI 7900HT序列檢測系統(Applied Biosystems)顯示。管家基因HPRT1和GAPDH作為對照。所有的引物和探針序列見表2。TLR-2和TLR-4 mRNA表達水平通過使用2-ΔΔCt方法與管家基因水平進行分析。

表2 定量PCR中各基因引物序列和探針

2 數據分析

數據使用SPSS軟件分析(SPSS 21)。每項實驗都重復進行，得到的數據用平均數±標準差表示。兩獨立組之間的差異用t檢驗，多組之間用方差分析檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 BDKRB2基因多態性+9/-9對骨關節炎患者血清與滑液中促炎細胞因子水平的影響

ELISA結果顯示，OA患者血清和滑液中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β 4個促炎細胞因子水平顯著高于健康對照組(圖1，P<0.01)。BDKRB2基因多態性+9/-9與促炎細胞因子水平間的相關性分析結果顯示，OA患者中，-9/-9基因型組血清和滑液TNF-α和IL-8水平顯著高于+9/+9組(圖2A、2E，2D、2H，P<0.05)；而-9/-9和+9/-9基因型組IL-6水平顯著高于+9/+9基因型組(圖2C、2G，P<0.05)。然而各組IL-1β水平差異無統計學意義(圖2B、2F)。各基因型健康對照組的促炎細胞因子差異均無統計學意義。這些結果表明BDKRB2基因多態性+9/-9影響骨關節炎患者血清與滑液中促炎細胞因子水平。

3.2 BDKRB2基因多態性+9/-9與OA患者滑膜組織中TLR-2表達的關系

圖1 OA患者和健康對照者血清和滑液中促炎性細胞因子水平。血清組(A～D)和滑膜液組(E～H)；A，E：炎性細胞因子水平TNF-α；B，F：IL-1β；C，G：IL-6；D，H：IL-8。OA組(n=156)和對照組(n=121)，**P<0.01Fig.1 Pro-inflammatory cytokine levels in OA patients and healthy controls. Levels of TNF-α (A, E), IL-1β (B, F), IL-6 (C, G), and IL-8 (D, H) in the serum (A-D) and synovial fluid (SF) (E-H) of OA patients (n=156) and healthy controls (n=121) were determined by EILSA,**P< 0.01.

TLR-2和TLR-4或許參與OA發病。與其他研究者的發現一致，本研究結果也顯示與健康對照組相比，OA患者滑膜組織中TLR-2和TLR-4表達上調(圖3A，P<0.01)。在OA患者中，-9/-9和+9/-9基因型組TLR-2 mRNA水平顯著高于+9/+9基因型組(圖3B，P<0.01)，但TLR-4 mRNA水平差異無統計學意義(圖3C)。健康對照組中，TLR-2和TLR-4水平差異均無統計學意義(圖3B、3C)。這些結果說明BDKRB2基因多態性+9/-9與TLR-2表達密切相關。

3.3 BDKRB2通過TLR-2調節人OA滑膜細胞中促炎細胞因子的分泌

研究發現，BK可以刺激人OA滑膜細胞IL-6和IL-8因子的分泌增加，MEN16132緩激肽機制劑抑制BK的效應。然而，各處理組中TNF-α的分泌無顯著變化(圖4A)，同時TLR-2 siRNA也顯著抑制基礎及緩激肽誘導的IL-6和IL-8的分泌(圖4B、4C，P<0.01)。

4 討論

圖2 OA患者和健康對照者血清和滑液中促炎細胞因子水平與BDKRB2基因多態性+9/-9的關系。血清組(A～D)和滑膜液組(E～H)；通過ELISA測定各細胞因子水平：TNF-α(A，E)；IL- 1β(B，F)；IL-6 (C，G)；IL-8 (D，H)；BDKRB2 +9/+9，+9/-9和-9/- 9基因型(OA：n=28、75、53；對照組：n=29、68、24)，*P<0.05，ns=差異無統計學意義Fig.2 Pro-inflammatory cytokine levels in OA patients are significantly associated with the BDKRB2 +9/-9 polymorphisms. Levels of TNF-α (A, E), IL- 1β (B, F), IL-6 (C, G), and IL-8 (D, H) in the serum (A-D) and synovial fluid (SF) of OA patients and healthy controls carrying the genotype (OA: n=28, 75, 53, respectively; controls: n=29, 68, 24, respectively) were determined by ELISA, *P<0.05, ns=no significant.

圖3 OA患者和健康對照者滑膜組織中TLR mRNA水平及其與BDKRB2基因多態性+9/-9的關系A：TLR-2和TLR-4 mRNA表達水平；B、C：TLR-2(B)和TLR-4(C) mRNA不同基因型表達水平。OA組(n=156)和健康對照組(n=121)；BDKRB2 +9/+9，+9/-9和-9/- 9基因型(OA：n=28、75、53；對照組：n=29、68、24)，**P<0.01，ns=差異無統計學意義Fig.3 TLR-2 expression in OA synovial tissues is significantly associated with the BDKRB2 +9/-9 polymorphisms.A:TLR-2 and TLR-4 mRNA expression in synovial tissues of OA patients (n=156) and healthy controls (n=121) determined by qRT-PCR;B, C:TLR-2 (B) and TLR-4 (C) mRNA expression in synovial tissues of OA patients and healthy controls carrying the BDKRB2 +9/+9, +9/-9, or -9/-9 genotype (OA: n=28, 75, 53, respectively; controls: n=29, 68, 24, respectively) determined by qRT-PCR,**P<0.01, ns=no significant difference.

圖4 人OA滑膜細胞中TLR-2沉默抑制基礎和緩激肽誘導的促炎性細胞因子的分泌。TNF-α (A)、IL-6(B)和IL-8(C)的水平通過EILSA測得，取6份患者樣本，所有實驗重復進行；*P<0.05，**P<0.01 vs 對照組；##P<0.01 vs BK對照組，ns=差異無統計學意義Fig.4 TLR-2 silencing inhibits basal and bradykinin-stimulated pro-inflammatory cytokine secretion in human OA synoviocytes. TNF-α (A), IL-6 (B), and IL-8(C) levels in the culture medium were determined by EILSA, Samples from 6 patients were used. Each experiment was performed in duplicate.*P<0.05,**P<0.01 vs. control; ##P<0.01 vs. control with bradykinin, ns=no significant difference.

由于BDKRB2+9/-9基因多態性和滑膜炎癥在OA的發生發展中有著重要的作用，因此筆者研究了在OA患者和健康對照組中BDKRB2+9/-9基因多態性和促炎細胞因子水平之間的關系。本研究發現OA患者中，-9/-9型基因型患者血清和滑膜液的TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著高于+9/+9基因型組。此外，+9/-9基因型組IL-6水平也要顯著高于+9/+9基因型組。在隨后的研究中，發現在BDKRB2+9/-9基因多態性和OA患者滑膜組織中TLR-2表達也有重要的關聯。-9/-9和+9/-9基因型組TLR-2 mRNA水平顯著高于+9/+9基因型組。通過在培養基中加入MEN16132(BDKRB2抑制劑)和TLR-2 siRNA，都能顯著抑制基礎及緩激肽誘導的IL-6和IL-8的水平。這些結果能共同說明在OA患者中+9/-9基因多態性可以通過改變TLR-2表達上調促炎細胞因子水平。

已有研究證實BK及其受體參與很多急慢性炎癥的發生，BDKRB2拮抗劑已經被合成出治療相關性疾病例如類風濕性關節炎、炎性腸病、炎性皮膚病、哮喘、過敏、疼痛以及冠心病[25]。關節內特定的BDKRB2拮抗劑可以使OA患者達到鎮痛的效果[26]，通過阻斷BDKRB2在一定程度上具有潛在的治療OA作用。BDKRB2是一種通過激活磷脂酶C(phospholipase C，PLC) 和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的G蛋白偶聯受體。在人類滑膜細胞中BK通過激活PLC、p38、JNK、ERK1/2 MAPKs和NFκB這些通路來刺激IL-6、IL-8的分泌[20]。然而在人類的滑膜細胞中BK是如何和BDKRB2結合后激活NFκB通路機制尚不明確。由于NFκB是以TLRs信號的中心進行調節，于是將BK和TLR-2以及促炎細胞因子聯系起來進行分析。既往的研究也已經表明BK可以通過上調TLR-2和TLR-4水平，從而促進人牙齦成纖維細胞的炎癥反應[27-28]。因此推測BDKRB2+9/-9基因多態性可以通過改變TLR-2/TLR-4來影響促炎細胞因子水平。

以前的研究已經表明在人類的滑膜細胞中BK可以獨自誘導B2依賴性的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE-2)產物和環氧化酶 (cyclooxygenase，COX)-2的基因表達[29]。此外，BK還可以通過BDKRB2、p38、JNK、ERK1/2和NFκB等通路加強IL-1β誘導的COX-2基因表達以及增加PGE-2產物。因此，BDKRB2的阻斷可以通過干擾多個炎癥信號通路來抑制和減緩OA的進程。

5 結論

本次研究結果表明BDKRB2+9/-9基因多態性可以通過改變TLR-2表達影響膝OA中的促炎細胞因子水平，本文從BDKRB2+9/-9基因多態性的角度探究了在OA患者中可能存在的BDKRB2→TLR-2→IL-6、IL-8的這一分泌過程和機制。目前OA的預防和治療仍是一項世界難題，筆者希望通過這種機制的研究能為OA提供新的有效預防和治療靶點。