染料木黃酮通過促進VEGF 表達改善去勢大鼠骨質疏松的作用機制

蔡嚇明 魏建銘

福建莆田學院臨床醫學院，福建 莆田 351100

骨質疏松癥是骨組織微觀結構破壞導致骨脆性增加的全身性骨骼疾病。美國約有 800 多萬絕經后婦女患有骨質疏松[1]，雌激素替代療法是預防骨質疏松的方案之一，Gen是天然的黃酮類物質，由于其分子結構含有3個羥基而具有一定的抗氧化能力[2-3]。具有廣泛的生物學效應，如抗腫瘤，防治骨質疏松，改善更年期癥狀，治療心血管疾病等多方面效應[4-5]。本研究擬從血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 調控角度，探討染料木黃酮對骨質疏松的改善作用及其作用機理。

1 材料和方法

1.1 模型的建立

選用清潔級6月齡 SD雌性大鼠 40 只，體重200～220 g，由福州吳氏動物中心提供。去勢組切除大鼠兩側卵巢后沖洗縫合傷口，假手術組手術過程不切除卵巢而切除小塊脂肪組織。Gen(Sigma)30 mg /(kg·d)，1次/d。去卵巢術后第3天，對治療組大鼠進行Gen溶液灌胃處理。去卵巢組和假手術組每日分別以生理鹽水(6 ml/kg)灌胃。隨機分為對照組，假手術組、去勢組、Gen干預6周組、Gen干預12周組。

1.2 骨密度值檢測

采用雙能X線骨密度檢測儀(美國Lunar公司)，測定大鼠左后肢股骨和脛骨的骨密度，用自帶的軟件進行數據分析。

1.3 血清中VEGF測定

在處死大鼠前，采集腹主動脈血液，離心后收集100 μl血清。采用ELISA試劑盒對血清中的VEGF表達進行檢測，通過試劑盒提供的標準品進行梯度稀釋獲得標準曲線；在微量滴定板上加樣，在450 nm波長光讀取數值；VEGF濃度通過標準曲線來推算。用微量培養板分光光度計(Biotek)測定各樣品在540 nm處的吸光度，檢測VEGF表達變化。

1.4 骨組織計量學指標比較

麻醉取股骨，入4%多聚甲醛固定，逐級脫水脫脂后，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，制成蠟塊，連續切片(厚度4 μm)。蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡(日本Olympus BX51T-PHD-J11)觀察骨細胞與細胞外基質分布。隨機選取，高倍鏡不同視野各測定一次，空缺骨陷窩數所占視野骨陷窩數的百分數。

1.5 VEGF原位雜交表達

按照VEGFmRNA原位雜交試劑盒(博士德)具體步驟操作進行染色、觀察，圖像分析。探針序列(博海生物)為，5′GCTCT ACCTC CACCA TGCCA AGTGG TCCCA3′；5′GACCC TGGTG GACAT CTTCC AGGAG TACCC3′；5′GCAGC TTGAG TTAAA CGAAC GTACT TGCAG3′。原位雜交過程用預雜交液替代探針工作液作陰性對照。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 血清中VEGF測定

與對照組相比，假手術組沒有出現明顯改變。去勢組和干預6周組大鼠血清中VEGF表達明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.01)。干預12 周組血清VEGF表達量沒有明顯差異(P<0.01)(圖1)。

圖1 各組血清中VEGF，P<0.01Fig.1 Serum VEGF of every group, P<0.01

2.2 骨密度值比較

與對照組相比，假手術組沒有出現明顯改變。去勢組和干預6周組骨密度值明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.01)。干預12周組與對照組骨密度值相比，沒有明顯差異 (圖2)。

圖2 各組骨密度值，P<0.01Fig.2 The bone mineral density of every group, P<0.01

2.3 各組骨組織形態學比較

對照組股骨的骨小梁較多較厚(圖5A1)。假手術6周組骨小梁粗大稍厚，未見吸收或斷裂現象 (圖5A2)。去勢6周組骨小梁排列稀疏變薄，骨髓腔變大，可見空缺骨陷窩(圖5A3)。Gen干預6周組骨小梁尚未見大片成塊狀缺失，較多空缺骨陷窩(圖5A4)。Gen干預12周組股骨的骨小梁較多較厚，未見骨小梁斷裂，可見少量空缺骨陷窩(圖5A5)。

2.4 組織計量學指標測定統計學結果

圖5A 各組骨松質光鏡下結構特點，HE法，標尺示40 μmFig.5A Structure characteristics of the trabecular bone under light microscope (HE staining, bar=40 μm).圖5B 各組骨松質VEGF mRNA 表達的灰度值，原位雜交法，標尺示40 μmFig.5B Expression of VEGF mRNA in the trabecular bone using FISH method (bar=40 μm).

與對照組相比：假手術組空缺骨陷窩數沒有出現明顯改變，去勢組和干預6周組空缺骨陷窩數均高于正常對照組，差別有統計學意義(P<0.01)。干預12周組松質骨空缺骨陷窩數與對照組比較差別無統計學意義 (圖3)。

圖3 各組空缺骨陷窩數，P<0.01Fig.3 The empty bone lacuree of every group, P<0.01

圖4 各組VEGF mRNA表達灰度值，P<0.01Fig.4 Grayscale of VEGF mRNA of every group, P<0.01

2.5 VEGF mRNA 表達

VEGFmRNA 在對照組和假手術組股骨頭骨髓腔血管內皮細胞都呈陽性反應(圖5B1，B2)。去勢6周組VEGF mRNA 陽性反應定位于骨髓腔血管內皮細胞胞質內，胞質呈棕褐色，胞核未顯色(圖5B3)。Gen干預6周組大鼠股骨頭骨髓腔內皮細胞的表達稍增強，胞質呈棕黃色 (圖5B4)。Gen干預12周組大鼠股骨頭骨髓腔內皮細胞的胞質呈棕黃色，內皮細胞陽性反應細胞數增多 (圖5B5)。

2.6 VEGF mRNA 表達灰度值結果分析

與正常組比較，假手術組股骨頭VEGF mRNA 表達的灰度值無明顯差異。去勢組和干預6周組股骨頭VEGF mRNA 表達的灰度值有顯著性差異(P<0.01)。干預12周組大鼠 VEGF mRNA 的表達無明顯差異 (圖4)。

3 討論

雌激素受體是成骨細胞和破骨細胞主要受體，通過與雌激素的結合可以增加成骨細胞的活性，增強成骨過程。相關動物實驗證明去勢后雌激素水平下降，促成骨作用下降，而破骨作用保持不變，造成骨鹽代謝處于負平衡狀態，出現骨密度降低，骨代謝生化指標異常等骨質疏松的病理變化[6]。臨床表現為骨吸收大于骨形成，易發生骨折[8]，與本實驗相關的骨密度測定在評測骨折風險方面的特異性較高，骨密度下降可以引起骨小梁結構的破壞，導致骨強度的下降，從而形成骨質疏松。

研究顯示絕經后骨質疏松的發生可能與骨微血管的減少有關，骨質疏松是一個多因素，多階段的氧化應激過程，可直接或間接地對細胞產生各種毒性作用，甚至引起細胞凋亡或壞死導致內皮細胞損傷。導致股骨近端由于不同解剖位置出現微循環障礙而導致大面積的非灌注區形成，股骨頭組織廣泛缺血缺氧，引起生長阻滯和骨質疏松。局部血管生成對骨質疏松的發病和轉歸有著重要的影響。有研究發現去卵巢的骨質疏松小鼠骨內部血管分布明顯少于對照組，說明骨局部血管形成和骨質疏松有明顯的關聯[9]，血管生成在維持骨再生-骨吸收動態平衡過程中有重要作用。

本實驗的VEGFmRNA作為一種自分泌因子表達貫穿骨組織發育演變過程的始終。VEGF是目前發現的功能最強大促進新生血管形成的細胞因子，主要通過旁分泌途徑刺激血管內皮細胞有絲分裂和增加血管內皮細胞滲透性，在軟骨—骨系統中參與共同調控骨組織的分化、基質生成和細胞因子的表達，能夠很好反映成骨狀態。

實驗顯示Gen對成骨細胞和破骨細胞有直接作用，Gen可直接作用于這些細胞，并通過調節這些細胞分泌局部因子而影響骨代謝。Gen增加破骨細胞凋亡，抑制骨吸收，降低骨轉換，而增加骨密度[10]。已經有大量研究表明Gen對心血管疾病具有良好的防護作用，其主要通過以下途徑[11]，Gen通過氫原子及超氧化物酶系的活力發揮抗氧化的作用；Gen通過誘導金屬硫蛋白和影響其他氧化還原酶的表達，調節血脂作用，保護血管內皮細胞作用，抑制血管平滑肌細胞增生和血栓的形成。直接舒張血管作用等方面[12]。研究證實染料木黃酮可以對多種屬的細胞，如大鼠，兔等的血管內皮細胞具有明顯的抗氧化應激損傷作用。本結果顯示Gen可以增強大鼠成骨細胞血管VEGF的表達。可以通過促進血管形成，從而具有抗骨質疏松作用。Gen防治骨質疏松的作用顯著，但其量效關系及機制還需進一步研究。