杜仲黃酮類3種藥物成分治療大鼠骨質疏松的比較研究

袁真 閔珺 王愷 龍菲 王永靜 羅軍*

1. 南昌大學第二附屬醫院，江西 南昌 330006 2. 南昌大學第三附屬醫院，江西 南昌 330008

近年來，骨質疏松癥的發病率逐年增多，疼痛本身可降低患者的生活質量，脊柱變形、骨折可致殘，不僅患者生命質量受到嚴重影響，也給個人、家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。因此，治療骨質疏松成為當前迫切需解決的問題。杜仲葉具有抗骨質疏松的療效[1-2]，本課題組前期開展對杜仲葉提取物化學成分的系統研究發現，杜仲黃酮類抗絕經后骨質疏松能力最強。已有研究證實槲皮素、山奈酚、蘆丁這3種杜仲黃酮類藥效成分均有抗骨質疏松的作用[3-5]。本研究擬通過對比分析槲皮素、山奈酚、蘆丁3種主要黃酮類藥物成分相同濃度下抗骨質疏松的效果，為今后發展中藥治療絕經后骨質疏松癥提供有效的臨床依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物：10～11周齡健康雌性SD大鼠，體重230～280 g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。整個實驗期間，動物自由飲水，進食食料及動物墊料由南昌大學動物科技部提供，保持良好的通風，室溫在23 ℃～25 ℃，相對濕度在45%～55%。

1.1.2藥物：槲皮素、山奈酚、蘆丁、β-雌二醇、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)均由Sigma公司提供，產品批號：XSD201510008。

1.1.3主要儀器設備：(1)Micro CT檢測儀：由上海懷宇生物有限公司負責對股骨標本進行檢測。(2)自動生化分析儀：由南昌大學第二附屬醫院檢驗科負責對生化血、尿指標進行檢測。(3)體重測量儀器：英恒精品分析天平。

1.2 方法

1.2.1分組：SD大鼠51只，體重(243.66±3.89)g，在標準動物飼養房內適應性飼養1 w后，按體重隨機分成6組，各組大鼠的初始平均體重差異無統計學意義(P>0.05)。模型組(OVX組)：對SD大鼠進行麻醉后，從大鼠背部正中做縱行皮膚切口，分別在兩側切開背部肌筋膜，找到雙側卵巢，對雙側輸卵管進行結扎，切除雙側卵巢后進行肌筋膜及皮膚的縫合；假手術組(Sham組)：在分別切開雙側肌筋膜找到雙側卵巢后，在卵巢附近切除與卵巢重量大致相等的脂肪組織，隨后進行肌筋膜及皮膚的縫合；槲皮素組(Q+OVX組)、山奈酚組(K+OVX組)、蘆丁組(R+OVX)及雌激素組(E2+OVX組)的造模過程與模型組相同。術后給予腹腔注射濃度為10 mg/mL哌拉西林他唑巴坦鈉注射液1 mL，至術后第2天。術后第3天開始，Sham組、OVX組均每天給予3 mL CMC-Na灌胃，Q+OVX組、K+OVX組、R+OVX組及E2+OVX組每天按照50 mg/kg分別用槲皮素、山奈酚、蘆丁、β-雌二醇給予灌胃，余量用CMC-Na溶劑補齊至3 mL。每日觀察SD大鼠的活動情況，定期更換墊料，保證飲水和食物充足，每周進行重新稱重，對死亡大鼠進行解剖分析。總實驗時間為12 w。

1.2.2檢測指標：體重：每周對大鼠進行稱重1次，依據大鼠體重，調整給藥劑量。實驗結束時對大鼠子宮進行稱重。生化指標：灌胃給藥12 w以后，用標準采血針從SD大鼠股動脈處進行采血，收集血樣后立即送南昌大學第二附屬醫院生化室進行離心，選取上層血清進行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，肌酐(S-Cr)，鈣離子(S-Ca)及磷離子(S-P)濃度測定。從大鼠膀胱抽取尿液，并檢測尿液中鈣離子(U-Ca)和磷離子(U-P)的濃度水平。Micro-CT骨量測定：分離SD大鼠左側股骨，去除周圍附著的軟組織，置于Micro-CT線圈中，從大鼠股骨遠端頂端開始進行CT螺旋掃描，每18 μm作為一個斷層，從生長板底端開始向上分析100張，對松質骨進行三維重構，分別測定骨密度(bone mineral density，BMD)、骨小梁數量(structure linear density，Tb.N)、骨小梁厚度(structure thickness，Tb.Th)、相對骨體積(object surface/volume ratio，BV/TV)、結構模型指數(structure model index，SMI)。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 SD大鼠存活情況

整個實驗期間，SD大鼠存活50只，OVX組死亡1只。死亡原因分析：死亡前1天，此大鼠灌胃時出現藥物返嗆，大鼠左側胸前壁近腋前處可見包塊，觸之柔軟。于次日死亡，解剖大鼠后可見左前胸部肌肉腫脹，有惡臭，可見少量黃色粉末，死亡原因考慮灌胃時用力過度灌胃針劃破食管引起感染所致。

2.2 各組大鼠平均體重以及子宮平均重量

與Sham組比較，OVX組及3種藥物組大鼠的平均體重均明顯升高(P<0.01)，E2+OVX組與Sham組平均體重差異無統計學意義(P>0.05)，并且小于3個藥物組(P<0.05)；與OVX組比較，3個藥物組平均體重差異無統計學意義(P>0.05)。與Sham組比較，OVX組子宮平均重量低于Sham組(P<0.01)，加入雌激素后能夠明顯增加子宮重量(P<0.01)，3種藥物組之間子宮平均重量無明顯差異，但均能增加子宮體重(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠平均體重及子宮重量Table 1 Results of body weight and uterine weight of rats

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與OVX組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

2.3 各組大鼠尿液中Ca、P的含量

與Sham組相比，OVX組及3個藥物組U-Ca平均濃度明顯升高(P<0.01)；與OVX組相比，3種藥物組均能降低U-Ca的平均濃度(P<0.05)，但K+OVX組和 R+OVX組作用更強(P<0.01)；與Sham組相比，OVX各組的U-P平均濃度明顯升高(P<0.01)；與OVX組相比，3個藥物組的 U-P平均濃度減低(P<0.05)。見表2。

圖2 各組大鼠三維立體圖與BMD測定Fig.2 Three-dimensional stereogram and determination of bone mineral content注：與Sham組比較，★P<0.05，*P<0.01；與OVX組比較，▲P<0.05，◆P<0.01。

表2 各組大鼠尿液中Ca、P的含量檢測結果Table 2 Results of urinary Ca and P content (mmol/L,

注：與Sham組比較，★P<0.05，*P<0.01；與OVX組比較，▲P<0.05，◆P<0.01。

2.4 各組大鼠血清堿性磷酸酶的含量

與Sham組比較，OVX各組血液中ALP平均濃度增加(P<0.05)；與OVX組相比，山奈酚、蘆丁均能不同程度增強OVX誘導的ALP活性的升高(P<0.05)。槲皮素組的ALP與OVX組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠中血清堿性磷酸酶測定結果Fig.1 Determination of serum alkaline phosphatase注：與Sham組比較，★P<0.05，*P<0.01；與OVX組比較，▲P<0.05，◆P<0.01。

2.5 各組大鼠Micro-CT股骨干骺端掃描結果和骨密度測定

從Micro-CT三維重構圖可以看出，各組大鼠股骨之間的骨小梁存在不同程度的差別，且與BMD檢測結果一致，即與Sham組比較，OVX組大鼠的BMD值均降低(P<0.01)，與OVX組比較，經過槲皮素、山奈酚以及蘆丁藥物治療后，BMD增加(P<0.05)。見圖2。

2.6 骨微結構檢測結果

通過Micro-CT進行三維立體掃描，發現各組之間的骨性微結構存在一定程度的差異性。與Sham組相比，OVX各組骨樣本中的BMD、Tb.N、Tb.Th、BV/TV均顯著低于Sham組(P<0.01)，然而SMI含量相對增加(P<0.01)；與OVX組相比，槲皮素能一定程度上改善股骨微結構(P<0.05)，但效果不如山奈酚和蘆丁作用明顯(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠骨相關參數測定Table 3 Bone related parameters

注：與Sham組比較，★P<0.05，*P<0.01；與OVX組比較，▲P<0.05，◆P<0.01。

3 討論

大量研究證實杜仲能夠對骨代謝發揮重要的作用，為了更充分地利用好其在骨代謝中的優點，對其復雜的化學成分進行逐一研究成為必然。杜仲中黃酮含量豐富，大量研究證實黃酮具有促成骨分化的作用，但其作用機制仍不十分明確。

黃酮亞類包括槲皮素、蘆丁、金絲桃苷、山奈酚等，研究證明槲皮素對于脂肪來源的干細胞(adipose-derived stem cell，ADSC)具有抑制增殖和促進成骨分化的作用，且對于促進成骨分化具有濃度依賴性。經槲皮素作用后的hADSC能夠在顱骨缺損的小鼠中顯示更好的骨再生能力，且研究證實槲皮素促進成骨分化是通過ERK通路進行的[6]，也有一些研究認為槲皮素促進成骨是通過作用于細胞上雌激素受體而發揮作用的。Kim等[4]通過研究山奈酚誘導的自噬對成骨細胞MC3T3-E1細胞分化和成礦的作用，證實山奈酚能夠增加骨密度，改善骨微結構。另外，一項研究證明向去除卵巢的大鼠飲食中添加 0.25%的蘆丁能夠減緩骨吸收，特別是能夠抑制雌二醇缺失所致的骨量丟失[7]。故而此次實驗首先從黃酮類單體篩選出槲皮素、山奈酚以及蘆丁3種藥物進行對比分析，為后續關于杜仲的研究打下基礎。

本研究選取了12周齡的SD大鼠，去勢后造成絕經后骨質疏松大鼠模型(OP大鼠模型)，結果顯示空白組的雌激素水平，骨小梁厚度、骨表面積、骨密度測定值均顯著高于OP模型組，表明造模成功。

骨是由骨礦物質與骨基質兩大部分組成。由于骨細胞的活動，新骨不斷形成，舊骨不斷被沉積到骨上，同時又不斷從骨中釋放到血液循環中。通過測定血、尿中這些礦物質的含量也可以間接了解骨代謝情況。本實驗的結果顯示血清鈣離子、磷離子以及肌酐濃度水平之間無明顯差異性，而尿鈣和尿磷的排泄，也就是鈣磷吸收的降低，可能與骨密度的下降有一定相關性[8]。這也與本實驗結果一致，OVX組大鼠尿鈣和磷的水平明顯較Sham組高，而槲皮素、山奈酚、蘆丁治療能夠顯著降低尿鈣和磷的水平，且山奈酚的作用效果優于槲皮素和蘆丁。堿性磷酸酶是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎臟和胎盤等組織中的一種酶，是骨形成的標志。本實驗發現OVX組大鼠的堿性磷酸酶活性明顯升高，表明骨形成能力增強，但由于缺乏雌激素所導致骨吸收的增加大于骨形成，骨量減少，造成骨質疏松癥的發生。在山奈酚和蘆丁對OVX大鼠進行藥物干預后，堿性磷酸酶水平顯著升高，表明二者能夠促進骨形成，增加骨轉換。同時，實驗也證實槲皮素對堿性磷酸酶活性無影響[9]。

BMD被認為是目前唯一能夠代表骨強度的測量標準[10]。筆者通過測定大鼠股骨干骺端骨礦物含量、骨小梁厚度、骨小梁數量、相對骨體積等特定參數評估山奈酚、槲皮素、蘆丁對成熟雌性大鼠體內成骨的影響。結果顯示去卵巢大鼠在造模12 w后，股骨BMD明顯降低。另有研究表明糞便與尿液中鈣的排泄減少和血液中鈣的吸收增加可能有助于防止骨密度的降低[11-12]，這與本研究結果中山奈酚、槲皮素、蘆丁各組血清ALP活性水平增高、尿鈣尿磷減低一致。以上各組通過抑制骨重塑來達到穩定骨量的結果與E2組的結果一致，且進一步表明山奈酚抗骨質疏松的作用強于蘆丁和槲皮素。

植物性雌激素具有對骨的雌激素樣作用，可增加BMD，抑制骨吸收。山奈酚、槲皮素、蘆丁3者均具有類似植物雌激素抑制骨吸收的作用，并與雌激素競爭性參與雌激素受體(estrogen receptor，ER)的結合[13]。Dang等[14]的研究表明，雌激素在刺激成骨細胞系的原始細胞向成骨細胞分化過程中起重要作用。鼠和人的ERs具有α和β兩種亞型，ERβ亞型在骨組織的表達量高于ERα。ERα亞型主要分布于生殖細胞中，尤其是乳房和子宮。另一項研究表明，ERβ樣免疫反應存在于小鼠和人類成骨細胞和骨細胞的細胞核中與破骨細胞和軟骨細胞的細胞質中[15]。ERβmRNA出現在小鼠成骨細胞中，其主要存在于干骺端骨小梁表面[16]。OVX所導致的雌激素缺乏能顯著增加大鼠體重，而E2能有效控制OVX大鼠體重的增加。本研究結果表明，山奈酚、槲皮素、蘆丁均不能抑制OVX導致的大鼠體重增加，說明以上3種黃酮單體并不具有類似于E2調節OVX大鼠子宮生長的功能。研究還發現，山奈酚、槲皮素、蘆丁均可增加BMD和改善骨小梁微結構，且子宮重量增加不如雌激素明顯，表明這3種黃酮單體可能對ERβ比ERα有更高的親和力。由此表明，杜仲黃酮對子宮低刺激性這一特點，使其比臨床上其他預防骨質疏松癥的藥物具有更大優勢。

另外，筆者采用Micro-CT對股骨的干骺端骨小梁微結構特性進行分析。結果提示OVX導致骨小梁結構不良，BV/TV、TB.N、Tb.Th均下降，骨小梁出現斷裂甚至消失，而SMI指數顯著升高。SMI是反映骨小梁板狀和桿狀程度的重要指標，0～3分別代表板狀骨小梁和桿狀骨小梁[17]。本研究表明，藥物治療組骨小梁結構從桿狀向桿狀混合板狀結構轉變明顯，尤其是山奈酚組。雖然槲皮素、蘆丁、山奈酚組均能對骨小梁微結構改變有積極影響，但無論是雌激素治療組還是藥物治療組均不能使骨小梁結構完全恢復。本研究結果與其他研究人員得出的結論一致[18-20]，即骨小梁結構退化已經發生改變后，其結構完整性不能完全恢復。這一發現強調了預防骨小梁丟失的必要性。

綜上所述,槲皮素、山奈酚和蘆丁這3種藥物均有抗絕經后骨質疏松的作用，且在相同的藥物劑量下，山奈酚的作用效果最強，蘆丁次之，槲皮素最弱。筆者通過分離大鼠右側的股骨，已經提取并獲得了以上各組大鼠的骨間充質干細胞，課題組將從蛋白以及基因層面對上述3種藥物的抗絕經后骨質疏松的作用及其毒副作用進行更進一步的研究。