觀察松質骨BMG作為組織工程軟骨載體的可行性和有效性

蔡曉陽 徐利民 陳慶煌 趙春安

1. 國立華僑大學醫院骨科，福建 泉州 362011 2. 四川省隆昌縣人民醫院，四川 內江 642150 3. 泉州市福建醫科大學第二附屬醫院骨科，福建 泉州 362011

軟骨損傷是全球常見的健康問題，由于供體材料稀缺、容易退變等問題導致軟骨修復成為骨科領域的重點難題。隨著組織工程的發展，軟骨細胞單層培養已經取得了一系列有價值的成果[1,2]。然而，軟骨細胞單層培養與體內的軟骨結構存在很大不同，其中一個關鍵的差異為缺乏細胞之間或細胞與細胞外基質之間的生物相容性支架，它為種子細胞的粘附、遷移和分化提供三維物理支持，導致單層培養物中暴露的軟骨細胞易于脫分化，喪失其原始基因表達譜和表型，最終在研究軟骨病的發病機制和治療中失去應用價值[3,4]。近年來，不少學者已經在軟骨組織工程中開發和測試了許多支架[5,6]，然而截止到目前尚沒有發現一種理想的支架。本研究中，我們將高度多孔的松質骨BMG作為組織工程軟骨載體，探討其負載兔關節軟骨細胞來進行軟骨修復的可行性。

1 材料與方法

1.1 松質骨BMG的制備

根據Wang等[7]報道的一些修改方法制備了BMG。從新鮮安樂死的成年新西蘭白兔收獲肱骨，去除所有軟組織和骨髓，并用無菌去離子水洗滌骨骼。然后將清潔的骨骼在磁力攪拌器中進行以下連續步驟：(1)室溫下將骨骼浸置于氯仿-甲醇(1∶1)混合液中過夜以除去脂質；(2)在4 ℃下浸置于0.6 M鹽酸中軟化12～36 h，得到不同的機械強度骨骼；(3)在4 ℃下用2 M CaCl2洗滌2 h以提取較低分子量的蛋白質多糖；(4)在4 ℃下用0.5 M EDTA洗滌2 h以去除非分散鈣和提取蛋白質多糖；(5)在4 ℃下用8 M LiCl洗滌以收縮膠原纖維，并提取高分子量蛋白質多糖；(6)在55 ℃下用去離子水洗滌2 h以提取骨膠的可溶性部分。在每個步驟之間，骨材料用無菌去離子水洗滌。將制備好的BMG切成直徑為3 mm的球形，用環氧乙烷滅菌并儲存在-80 ℃冰箱中以備使用。

1.2 BMG的表征

制備的BMG在BX51-P光學顯微鏡(奧林巴斯公司)下拍照觀察，并通過s570掃描電子顯微鏡(HITACHI公司)分析BMG超微結構的表征。

1.3 軟骨細胞的分離和培養

無菌環境下從1個月大的新西蘭白兔的髖關節、膝關節和肩關節獲得關節軟骨標本，并置于含有雙抗的D-Hank溶液中。將軟骨樣品切成糊狀，在37 ℃環境下依次在0.05%透明質酸酶、0.2%胰蛋白酶和0.2%膠原酶II型中消化10 min、30 min和1 h。然后使用尼龍網過濾器過濾細胞懸浮液，將得到的濾液以65 g離心10 min，去掉上清，將細胞沉淀重新懸浮于改良的Eagle培養基(含30%胎牛血清和雙抗)。將軟骨細胞(5×105個)接種在25 cm2培養瓶中，在5%CO2、37 ℃環境中培養。培養基每2天更換一次。

1.4 松質骨BMG和軟骨細胞復合體的構建

取培養軟骨細胞，在0.2%胰蛋白酶中消化10 min，4℃65 g離心10 min，棄上清，取軟骨細胞(2×106)重懸于100 μL Eagle培養基中，接種到已經放置在10 mL離心管底部的松質骨BMG上。接種30 min后，將4 mL Eagle培養基小心地加入到軟骨細胞-松質骨BMG復合體中。繼續培養復合體7 w，培養基每3 天更換一次。

1.5 組織工程軟骨的組織學觀察

分別在培養第1、4、7 w時獲取工程軟骨組織(n=5)，用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，用石蠟包埋。切成5 μm的薄片，用蘇木精和曙紅(HE)進行整體染色，用甲苯胺藍染色觀察蛋白聚糖表達，免疫組化染色觀察I型和II型膠原蛋白的表達。隨機選取1、4、7 w每個時間點的5個切片，計算出整個組織工程軟骨中新形成的軟骨組織的百分比。在整個工程組織中新形成的軟骨組織的百分比=(新形成的軟骨/整體工程組織)×100%。

蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達用Image Pro-Plus 5.1圖像分析軟件進行半定量分析。隨機選取培養1、4、7 w每個時間點的5個切片。掃描和分析每個部分的六個膠原蛋白或蛋白聚糖表達。所得到的灰度值表示掃描場的透射光強度,較高的灰度值表示該部分的色素沉著減少，這表明蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達水平較低。平均灰度值=所有灰度值總和÷總面積。平均灰度值越低，陽性表達水平越強烈。

1.6 數據分析

2 結果

2.1 松質骨BMG的表征

圖3 松質骨BMG和軟骨細胞復合體構建過程的組織學表現。(a)、(b)、(c)為HE染色，(d)、(e)、(f)為蛋白聚糖甲苯胺藍染色(紫色表達為陽性)，(g)，(h)，(i)-II型膠原免疫染色(橙色表達為陽性)；(a)、(d)、(g)-1 w，(b)、(e)、(h)-4 w，(c)、(f)、(i)-7 wFig.3 Histological observation of chondrocytes cultured on the cancellous BMG. (a), (b), (c) HE staining; (d), (e), (f) Proteoglycan toluidine blue staining (positive expression was purple); (g), (h), (i) Type II collagen immunostaining (positive expression was orange); (a), (d), (g): At week 1; (b), (e), (h) At week 4; (c), (f), (i) At week 7

制備的松質骨BMG是多孔的，它可以輕易地修剪成不同的尺寸和輪廓，例如3 mm的球形(圖1)。掃描電子顯微鏡下觀察到在100～400 μm范圍內的松質骨BMG中的通孔(圖2 a)，當軟骨細胞-松質骨BMG復合體培養24 h后，軟骨細胞均牢固地附著在松質骨BMG表面和微孔上，形成互連和集群(圖2b)。

圖1 松質骨BMG的代表性宏觀圖像Fig.1 Macroscopic images of the cancellous BMG

2.2 組織學觀察結果

培養第1周時，HE染色顯示，松質骨BMG周圍的軟骨細胞數量明顯增多，大多數軟骨細胞顯示出紡錘狀形態(圖3 a)。甲苯胺藍和免疫組織化學染色表明，在BMG支架上的接種的軟骨細胞產生蛋白聚糖(圖3 d)和II型膠原(圖3 g)。

培養第4周時，在BMG表面形成軟骨組織，較多的軟骨細胞在BMG的中心區域生長(圖3b)。同時，BMG支架結構中合成的基質對軟骨細胞特異性蛋白聚糖(圖3e)和II型膠原(圖3 h)染色明顯增強。

培養第7周時，BMG表面形成的軟骨組織的厚度沒有明顯增加，但軟骨細胞在BMG內部明顯增殖，軟骨組織形成于松質骨BMG的整個孔中(圖3c)。軟骨細胞富含蛋白聚糖(圖3f)和II型膠原(圖3i)均勻分布在BMG周圍，同時松質骨BMG由于收縮或降解很難辨別。在第1、4、7 w均沒有觀察到Ⅰ型膠原蛋白表達。

2.3 軟骨組織形成和蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白表達情況

使用Image J分析軟骨中新形成的軟骨組織的百分比。培養時間為1、4、7 w，新形成的軟骨組織百分比分別為(11.43±2.16)%、(27.41±4.42) %和(44.89±6.05) %，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明，隨著培養時間的推移，軟骨組織的形成顯著增加(圖4)。

軟骨中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白表達的半定量分析顯示，培養時間為1、4、7 w，Ⅱ型膠原蛋白的平均灰度值分別為153.62±6.37、135.49±7.05和120.18±5.34，差異有統計學意義(P<0.05)；蛋白聚糖的平均灰度值分別為144.69±4.05、120.37±2.85、101.96±3.52，差異有統計學意義(P<0.05)。結果提示隨著培養時間延長，軟骨中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白含量呈顯著增加趨勢(圖5)。

圖4 不同培養時間新形成的軟骨組織百分比注：與第1周相比，*P<0.05；與第4周相比，#P<0.05Fig.4 Percentage of newly formed cartilaginous tissue at different culture times

圖5 松質骨BMG和軟骨細胞復合體產生的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的平均灰度值注：與第1周相比，*P<0.05；與第4周相比，#P<0.05Fig.5 Average gray value of proteoglycan and type II collagen produced by chondrocytes on the cancellous BMG

3 討論

組織工程軟骨的成功構建需要合適的支架來促進細胞增殖并維持分化表型。然而到目前為止，尚未發現理想的支架材料。軟骨組織工程的理想支架應具備的特性有[8,9]：①顯著的低免疫原性和生物相容性；②良好的可降解性，具有可控的降解速率，以匹配新組織再生速度；③高度多孔，以促進氣體交換，營養和代謝廢物擴散；④具有機械穩定性，以防止由于過早崩潰引起的新軟骨組織形成和關節處的外部應力；⑤生產和儲存方便。

在本研究中，我們通過用稀鹽酸提取骨來去除礦物質，然后用濃縮的CaCl2去除蛋白質和多糖部分，并將LiCl作為變性劑收縮膠原纖維并將膠原轉化為不溶性骨明膠制備BMG。通過脫脂、去礦化和去蛋白質多糖的方法制備的BMG，去除了95%的非膠原蛋白，消除BMG內的抗原物質，使其與宿主相比具有較弱的免疫原性的生物相容性。此外，如Zhang[10]等觀察到的，BMG制備過程保留了一定量的骨形態發生蛋白和在異位植入試驗中仍具有生物活性的其他軟骨形成因子。以往的研究表明，BMG可以在體外誘導間充質細胞分化成軟骨細胞，并在體內軟骨缺陷中形成透明樣軟骨[11]。

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是負責BMG潛在的軟骨誘導活性的主要因子。其中，BMP-2和BMP-7等已經獲得較大突破，已被廣泛應用于軟骨組織工程中，可促進軟骨細胞增殖，刺激蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達，維持分化狀態[12,13]。因此，當細胞在BMG上培養時，埋藏在BMG中的BMP可以通過降解過程暴露和釋放，從而促進永久性軟骨形成。研究發現，當BMG在體內被植入骨缺損時，在缺損部位招募的間充質干細胞(MSC)將受支架BMG及周圍環境的影響。當存在成骨環境，例如足夠的血液供應和合適的氧氣壓力時，軟骨細胞將變得肥大并進一步分化成骨細胞[14,15]；當沒有成骨環境，如體外組織工程實驗時，由于氧氣壓力相對較低，血液供應不足，松質骨BMG主要作為支架，支持軟骨細胞的三維生長，而不促進進一步成骨分化。因此，本研究中沒有在松質骨BMG和軟骨細胞復合體中觀察到I型膠原表達。

BMG已經被構建成一個骨骼軟骨替代物，Bergen等[16]將第1代(P1)的原代軟骨細胞與皮質BMG組合，結果皮質BMG上產生具有層狀層的1.3 mm厚的透明樣軟骨，但是由于軟骨細胞很少滲透到內部區域，導致軟骨外殼與皮質BMG的整合較弱，最終使得該組織工程化的軟骨帽與基底的BMG支架分離并破碎，分析原因為皮層BMG的孔徑范圍為15 μm左右，而基于早期研究，根據細胞大小、遷移要求和物質運輸需求，支架孔徑的最小要求應為100 μm[17]。因此，本研究中使用的松質骨BMG是高度多孔的，內部孔尺寸為100～400 μm，允許軟骨細胞生長到每個孔中，隨著培養時間的推移，軟骨組織的形成顯著增加，并且蛋白聚糖和膠原II型遍及松質骨BMG的整個孔。上述結果提示松質骨BMG可以為軟骨細胞增殖提供適宜的空間，有利于維持細胞表型，并促進代謝物質的交換。

此外，通過應用不同的脫鹽時間和去礦化時間來獲得不同生物降解性和機械強度松質骨BMG。研究中，在培養第6周時觀察到松質骨BMG的明顯收縮或降解，與新軟骨組織的形成顯著同步。隨著這種優異的生物降解性，松質骨BMG可以為軟骨細胞增殖和蛋白聚糖及膠原II型沉積提供空間。基于其可調節的機械強度，松質骨BMG可以容易地修剪成所需的形狀和尺寸，以適應不同的修復和再生缺陷，從而賦予骨科和牙科外科醫生能夠根據個體修復需要定制骨軟骨移植物。制備后，松質骨BMG可以在低溫(-80 ℃)下長時間保存，對其生物活性沒有不利影響。

綜上所述，松質骨BMG具有良好的生物相容性，可控的機械強度和降解速率，顯著的低免疫原性，高可用性和合適的孔隙率，所以是一種較理想的支架材料。