神經肽在去卵巢大鼠骨組織中表達差異的實驗研究

王雙磊 韓燚 謝瑋鑫 李展春* 肖潔

1. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院骨關節外科, 上海 200127 2. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院麻醉科, 上海 200127

骨質疏松是威脅絕經后老年女性人群健康的常見病之一。 絕經后的女性, 表現為雌激素下降, 骨代謝加快, 同時伴隨骨量丟失和骨強度降低, 機體往往經受輕微的創傷就容易發生骨折, 因此防治絕經后骨質疏松對促進老年女性健康以及提高其生活質量有著重要意義。P物質(substance P, SP), 降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP), 血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)和神經肽Y(neuropeptide Y, NPY)由背根神經節或交感/副交感神經節合成, 運輸到骨和骨膜上的豐富的交感神經和感覺神經末梢, 以密集囊泡的方式儲存以及釋放。SP, CGRP, VIP和NPY與骨組織中的成骨細胞, 破骨細胞, 骨細胞, 骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)上的神經肽受體結合, 對骨組織的生長, 代謝和骨重建發揮調節作用[1-3]。本實驗通過檢測SP, CGRP, VIP和NPY在去卵巢大鼠和假手術大鼠脛骨干骺端的表達及其與骨密度(bone mineral density, BMD)之間的關系, 探討神經肽在骨質疏松發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：清潔級(SPF)6月齡雌性未孕Sprague-Dawley大鼠12只, 由上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院動物實驗室提供。

1.1.2實驗設備：電子天平；烘箱(上海博訊)；高壓滅菌器(SANYA公司)；美國LUNAR 雙能X線骨密度儀(DXA)。

1.1.3實驗材料：多聚甲醛(碧云天公司)；戊巴比妥鈉(碧云天公司)；0.9%氯化鈉溶液(上海百特醫療用品有限公司)；青霉素；四肽(抗-SP抗體, 1∶1000, Abcam, Cambridge, USA；抗-CGRP抗體, 1∶400, Abcam, Cambridge, USA；抗-VIP抗體, 1:20, Abcam, Cambridge, USA；抗-NPY抗體, 1∶1000, Abcam, Cambridge, USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗動物分組及模型制備：清潔級(SPF)6月齡雌性未孕SD大鼠12只, 體重290～310 g, 隨機分為兩組(n=12)：去卵巢組(OVX)和假手術組(Sham)。兩組大鼠采用腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg), 去卵巢組大鼠經腰背部雙側切口進入腹腔, 切除雙側卵巢。假手術組：在卵巢附近切除和卵巢重量相等的脂肪。去卵巢組和假手術組大鼠均分開飼養在相同鼠籠, 每日攝食量相當, 飲水不限。術后均予青霉素10萬U腹腔注射3 d預防感染。

1.2.2骨密度檢測：兩組動物術后均飼養12 w, 3%戊巴比妥麻醉后, 四肢展開平臥于雙能X線骨密度儀平臺上檢測骨密度。

1.2.3標本的制備：兩組動物術后均飼養12 w, 應用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后, 稱重后脫臼法處死大鼠, 取子宮稱重(濕重)。收集右側脛骨干骺端, 剔除軟組織后立即投入到4%多聚甲醛中, 室溫固定，EDTA脫鈣, 酒精梯度脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋。沿著縱軸切5 μm厚的切片，依次脫蠟，水化后，用煮沸的枸櫞酸進行抗原修復，PBS(0.01 mol/L,pH7.4)沖洗15 min, 含有3%H2O2的甲醇封閉內源性過氧化物酶活性10 min, 滴加正常的山羊血清封閉液，分別滴加Ⅰ抗4℃過夜，滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗，滴加S-P孵育15 min，DAB顯色，Mayer's蘇木精復染，常規脫水，封片。

1.2.4觀察和顯微攝影：在光學顯微鏡下選取陽性結果區進行拍照(E800, Nikon, Tokyo, Japan)SP, CGRP,VIP和NPY免疫陽性表現為棕色斑片狀或束狀。用Spot Advanced digital-imaging 系統(Diagnostic Instruments, Inc, Sterling Heights, MI, USA)在放大400倍的顯微鏡下選擇3個視野區進行觀察。用Pro Plus(version 5.0.1, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)軟件, 以MOD作為量化指標, 對免疫組化陽性表達進行量化。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 體重, 子宮濕重和BMD

造模后12 w, OVX組大鼠體重增加, 與Sham組比較差異具有統計學意義(P<0.01)；OVX組大鼠子宮濕重, BMD降低, 與Sham組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2 大鼠脛骨干骺端神經肽MOD值

造模后12 w, OVX組大鼠SP、CGRP和VIP的MOD值降低, 與Sham組比較差異具有統計學意義(P<0.01)；OVX組大鼠NPY的MOD值升高, 與Sham組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 造模后12 w, OVX組和Sham組大鼠體重, 子宮濕重和BMD值比較Table 1 Comparison of body weight, uterus weight and BMD of rats from Sham and OVX group

注：與Sham組相比較，*P<0.01

圖1 大鼠脛骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值與BMD之間的相關關系Fig.1 Relationship between BMD and the MOD of SP, CGRP, VIP and NPY of rats’ tibia metaphysis

表2 造模后12 w, OVX組和Sham組大鼠SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值比較Table 2 Comparison of MOD of SP, CGRP, VIP and NPY of rats from Sham and OVX group

注：與Sham組相比較，*P<0.01

2.3 大鼠脛骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值與BMD值之間的關系。

造模后12 w, 大鼠SP, VIP的MOD值與BMD值成正相關關系(r=0.746,P=0.005；r=0.591,P=0.043), 大鼠NPY的MOD值與BMD值成負相關關系(r=-0.666,P=0.018)。見圖1。

3 討論

本研究探討了OVX組大鼠與Sham組大鼠脛骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的表達。首先通過雙側去卵巢法建立雌激素缺乏的大鼠骨質疏松模型[4]。本研究中, 造模后12 w, OVX組大鼠BMD值(0.230±0.013) g/cm2低于Sham組大鼠BMD值(0.261±0.019) g/cm2, OVX組大鼠體重(450.49±44.42) g大于Sham組大鼠體重(334.39±44.18) g, OVX組大鼠子宮濕重(0.22±0.08) g低于Sham組大鼠子宮濕重(0.67±0.08) g, 差異具有統計學意義。本研究結果與其他類似的研究結果相同, 雙側卵巢切除術后大鼠體重增加, 子宮萎縮, BMD下降[5,6]。研究結果表明, 雙側卵巢切除術后12 w, 大鼠骨質疏松模型建立成功。

本研究表明, 與Sham組相比較, OVX組大鼠SP的MOD值降低, 差異具有統計學意義(P<0.01)。楊鋒等[7]研究表明，SP在骨質疏松大鼠骨組織中的表達降低。鄭新峰等[5]研究表明, 雙側卵巢切除術后3 w和6 w, 小鼠骨組織SP表達下降。Ding等[2]研究SP含量在OVX小鼠骨折愈合過程中的變化時發現, OVX組小鼠骨折部位SP含量低于對照組。兩組大鼠SP的MOD值與BMD值成正相關關系(r=0.746,P=0.005)。SP通過與細胞上的受體結合發揮生理病理作用，其中SP與神經激肽-1(neurokinin-1，NK-1)受體的結合力最大。NK-1受體在大鼠的BMSCs，成骨細胞，骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophages, BMMS)，破骨細胞上都有表達。體外實驗發現，SP能增加大鼠顱骨成骨細胞礦化小結的形成，SP的這種成骨作用能被NK-1受體拮抗劑所抑制[8]。高濃度的SP能刺激BMSCs的增殖和礦化，低濃度的SP能增加晚期BMSCs的成骨分化。正常大鼠松質骨中的SP濃度表現為低濃度， 本研究中OVX組比Sham組大鼠脛骨干骺端SP表達降低，SP對大鼠骨組織中BMSCs, 成骨細胞的成骨刺激作用減弱，導致成骨活性下降，骨密度降低，SP可能參與了骨質疏松的發生發展[9]。

本研究結果顯示, 與Sham組比較, OVX組大鼠CGRP的MOD值降低, 差異具有統計學意義(P<0.01)。CGRP通過提高細胞內轉錄激活因子-4(activating transcription factor-4,ATF4)和骨鈣素(osteocalcin, OC)的表達，刺激成骨細胞的分化；CGRP也能通過影響骨保護蛋白(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)的比值，抑制破骨細胞的生成[10]。BMSCs，成骨細胞，BMMS和破骨細胞都有CGRP受體的表達。CGRP(10-10-10-8mol/L)能刺激BMSCs增殖，上調成骨基因的表達，增加BMSCs堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和礦化程度。CGRP(10-8mol/L)能抑制BMM中NF-κB對RANKL的激活, 下調破骨基因，抑制BMMS的骨吸收活性[11,12]。這些研究表明，CGRP在體內生理濃度下具有促進骨形成，抑制骨吸收的作用。

NPY是神經系統合成和分泌的一種生物活性物質, 在骨組織中NPY通過與其特異性Y受體結合, 調節成骨細胞和破骨細胞的活性, 從而在骨的生理病理過程中發揮重要作用。骨組織中成骨細胞系細胞上有NPY Y1受體的表達，NPY Y2受體在骨組織中不表達。NPY能抑制BMSCs到成骨細胞系的分化，降低大鼠顱骨成骨細胞分化基因的表達和礦物質的沉積[13]。本研究結果顯示, 與Sham組比較, OVX組大鼠NPY的MOD值升高, 差異具有統計學意義(P<0.05)；大鼠NPY的MOD值與BMD值成負相關關系(r=-0.666,P=0.018)。Xiao等[3]在研究絕經后骨質疏松患者和骨性關節炎患者的股骨頭松質骨神經肽表達和骨微結構時發現, 相對于骨性關節炎患者, 骨質疏松患者的股骨頭松質骨SP, CGRP和VIP表達降低, NPY表達增高。本研究結果發現, 相對于Sham組大鼠, OVX組大鼠表現為SP, CGRP和VIP表達降低, NPY表達增高, 與上述研究結果相符。

神經纖維大多分布于骨組織中代謝活躍的部位。VIP是交感神經分泌的一種神經肽, VIP在骨膜、骨髓腔、血管中都有表達；VIP受體在骨膜、骨髓腔、 血管、成骨細胞、破骨細胞中有表達[14,15]。本研究結果顯示, 與Sham組比較, OVX組大鼠VIP的MOD值降低(P<0.01), 大鼠VIP的MOD值與BMD值成正相關關系(r=0.592,P=0.043)。大鼠成骨細胞表面有VIP type 2受體(VPAC2受體), VIP與VPAC2受體結合, 影響成骨細胞RANKL和OPG表達。VIP能通過降低RANKL/OPG的比值抑制破骨細胞的分化, 降低破骨細胞活性和骨吸收功能[14]。

本研究結果中, SP, CGRP和VIP在去卵巢組大鼠骨組織中表達降低, NPY在去卵巢組大鼠骨組織中表達升高, SP, VIP和NPY表達與MOD值之間有相關性, 由此推斷神經肽可能參與了去卵巢大鼠骨質疏松的發病機制, 影響這些神經肽的表達可能作為抗骨質疏松治療的一種方法。但是本研究中只探討了神經肽在骨組織中的變化, 且樣本量較低, 需要全面闡述神經肽在骨質疏松發生發展中的作用, 進一步探討可能的信號轉導機制, 為神經肽在骨質疏松疾病發生發展中提供理論基礎。