Micro-CT和骨力學測試觀察刺老苞根皮對骨折大鼠的作用

依香叫 燕夢云 王松月 李金誠 裴凌鵬

中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，北京 100081

骨折是一種常見型臨床多發病。據文獻報道[1]，隨著人口老齡化，預計到2020年，我國由骨質疏松癥導致髖部骨折人數將近163.82萬；到2050年，全球一半以上由骨質疏松癥導致的骨折病癥將發生在亞洲。因此，骨質疏松的防治及骨折的治療是國內外學者的研究熱點。本課題組所研究的刺老苞根皮是我國少數民族土家族習用草藥之一，為五加科楤木屬植物楤木(Aralia echinocaulis Hand. Mazz)及其變種白背葉楤木(Aralia chinensis L. var. nuda Nakai)的根皮或莖皮。具有滋陰補腎，祛風濕，壯筋骨，散淤血，消腫毒的功效。主要用于風濕痹痛、跌打損傷、骨折等治療。在治療骨相關疾病上，有著簡、便、廉、驗的特點。以往研究[2,3]已通過臨床試驗證明刺老苞膠囊對膝關節骨性關節炎有一定的療效，并且刺老苞根皮提取物能夠通過骨代謝、脂代謝及激素代謝促進由糖皮質激素誘發的骨質疏松大鼠骨組織的骨量、骨質和骨堿性磷酸酶活性[4,5]，并且可改善脛骨骨折模型大鼠的骨質代謝[6]。為了深入闡述刺老苞根皮對骨修復的作用，本次試驗以3月齡SD脛骨骨折模型大鼠為研究對象，應用骨力學檢測和Micro-CT檢測觀察不同濃度刺老苞根皮水提物對不同時間脛骨骨折模型大鼠的修復作用，進一步為臨床治療和應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雌性SD大鼠60只，3月齡，體重(270±20) g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗室動物中心提供，許可證編號：SCXK-(軍)2012-0004。標準動物房飼養，自由活動及飼料(普通Ⅱ號料)正常進食。

1.2 藥品與儀器

刺老苞根皮，采于湖北恩施地區(經北京中醫藥大學生藥系楊瑤珺教授鑒定)，批號：OP1101，湖北恩施中藥材有限公司。

自動旋轉蒸發儀(上海亞榮生化器)，Skyscan 1174 X-Ray Microtomograph(比利時Bruker公司)，Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(德國Leica公司)，臨床生物力學三點彎應變檢測儀(上海醫學儀器設備總公司)。

1.3 實驗動物模型建立

SPF級健康雌性SD大鼠60 只，通過在脛骨上打孔模擬骨折二期愈合的理想力學環境。模型建立具體方法：60只SD雌性大鼠適應性喂養一周后，用濃度為3 %戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔內注射麻醉。將動物固定后，左下肢脫毛，皮膚消毒。無菌條件下，自脛骨結節下端起，沿脛骨走行，做縱行切口，長1 cm。切開皮膚、皮下筋膜，剝開脛前肌，顯露脛骨。在脛骨結節下端2 mm處，用鑲嵌1 mm克氏針的打孔器自脛骨外側向脛骨內側打孔，直徑為1 mm，鉆透皮質深達髓腔，但不觸及對側皮質。在該孔下沿脛骨縱軸方向依次再打2個孔，每兩個孔的間距為5 mm。用生理鹽水徹底沖洗，滴1～2滴青霉素(80萬U/mL)逐層縫合切口。術后3 d連續肌注青霉素8萬U/只，預防感染。動物分籠飼養，術后第二天按實驗分組設計進行處理。

1.4 實驗分組設計及給藥

術后第二天用SPSS軟件隨機數字的方法分成4組，分別為模型組(MODEL)、刺老苞根皮低劑量組(CLB-L)、刺老苞根皮中劑量組(CLB-M)、刺老苞根皮高劑量組(CLB-H)，每組15只，參考骨折愈合藥物治療周期，每組設定3個觀測時間點，即14、21、28 d，每時間點5只。

取一定量干燥刺老苞根皮生藥置于圓底燒瓶中，加入10倍的蒸餾水，待沸騰后，120 ℃加熱，60 min后停止加熱，待冷卻后倒出煎液，再加入6倍蒸餾水，待沸騰后，120 ℃加熱，30 min后，冷卻倒出煎液，合并兩次水煎液。將混勻的水煎液置于自動旋轉蒸發儀中，濃縮至每100 mL含生藥36 g的水煎劑。用藥劑量根據人體習用安全劑量(20 g生藥/70 kg體重)，按人/鼠表面積比率換算等效計量法計算。刺老苞根皮灌胃劑量為1.8 g/(kg·d)，以臨床劑量為中劑量，1/2、2倍劑量為低、高劑量, 即分別為0.9 g/(kg·d)、1.8 g/(kg·d)。模型組給予等劑量等頻率蒸餾水，每天一次。

1.5 取材

分別于相應時間點取材(取材前禁食12 h)，末次給藥后1 h，稱重，3%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)腹腔注射麻醉，在無菌操作下腹主動脈采血，取雙側脛骨，剝離肌肉及筋膜。經生理鹽水沖洗后，用濕潤生理鹽水紗布包好，保證骨組織內水分不丟失，置于-20 ℃冰箱保存，用于骨力學檢測包括骨的結構力學參數(彈性撓度、彈性載荷、最大撓度、最大載荷)和生物力學參數(最大應力、最大應變、彈性應力、彈性應變)，Micro-CT檢測脛骨骨折部位骨組織形態參數(BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和SMI)檢測。

1.6 骨力學檢測

檢測時，取出-20 ℃保存的標本，用臨床生物力學三點彎應變檢測儀分析大鼠右側脛骨的骨力學性能。大鼠生物力學實驗時參數設置如下：最大載荷20 kg，壓頭對準斷端，跨度為18～22 mm，加載速度5～l0 mm/min，記錄紙速度500 mm/min，室溫控制在20 ℃。計算并繪制載荷-位移關系曲線、應力-應變關系曲線，從曲線上讀取及計算彈性撓度、彈性載荷、最大撓度、最大載荷、最大應力、最大應變、彈性應力、彈性應變等骨力學參數。

1.7 Micro-CT測量

檢測前，將左側脛骨浸泡于生理鹽水，待24 h后采用 Micro-CT 對其進行組織形態指標檢測：將脛骨放置于Micro-CT的標本管內，并用濕紙巾纏繞固定，防止掃描過程標本的脫水及移位。采用Skyscan1174型Micro-CT的Scaner軟件進行掃描，參數設定為：電壓50kV，電流800 μA，掃描空間分辨率12 μm，斷層圖像分辨率1304×1024 pixel，旋轉角度0.8 度，曝光時間5 300 ms，掃描完成后，用Data viewer軟件校值，再用 CT-AN 軟件選擇感興趣區域(ROI)，最后用CT vox軟件進行三維重構和分析。ROI選擇在距長板 1 mm 以下，厚度為 1.5 mm 的骨髓腔區域。分析得到以下參數：骨體積(bone volume，BV)、骨痂體積(total volume，TV)、骨體積分數(bone volume/total volume，BV/ TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁結構模型(structure model index，SMI)。

1.8 數據處理

2 結果

2.1 各組大鼠脛骨力學參數的變化

與MODEL組相比，不同時間點，各劑量組的骨結構力學參數有所提高。其中CLB-M組在14 d時最大撓度、最大載荷高于MODEL組(P<0.05)；21 d時彈性撓度、最大撓度、最大載荷明顯升高，與MODEL組相比差異有統計學意義(P<0.05)。28 d時彈性撓度、彈性載荷、最大撓度、最大載荷皆高于MODEL組(P<0.05)。CLB-H組在14、21、28 d時，彈性撓度、彈性載荷、最大撓度、最大載荷明顯高于MODEL組，差異有統計學意義(P<0.05)。

與MODEL組相比，最大應力在14 d時，CLB-H組上升，21 d時CLB-M組、CLB-H組上升，28 d時各劑量組上升，差異有統計學意義(P<0.05)；各劑量組最大應變高于MODEL組，但差異無統計學意義(P>0.05)；彈性應力在14 d時各劑量組升高(P<0.05)，21、28 d時，CLB-M組、CLB-H組升高(P<0.05)，彈性應變則在14、28 d時，CLB-H明顯高于MODEL組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠脛骨Micro-CT定量參數的變化

經Micro-CT檢測顯示：BV/TV在14 d時，CLB-H組高于MODEL組(P<0.05)；21 d時CLB-M、CLB-H組高于MODEL組(P<0.05)；28 d時，CLB-M組高于MODEL組(P<0.05)，CLB-H組明顯高于MODEL組(P<0.01)。Tb.Th、Tb.N在21、28 d時CLB-M組、CLB-H組明顯高于MODEL組(P<0.05或P<0.01)。Tb.Sp在21 d時CLB-M組、CLB-H組與MODEL組相比有所降低(P<0.05或P<0.01)；28 d時各劑量組與MODEL組相比皆有所降低。(P<0.05或P<0.01)。SMI在21、28 d時CLB-M組低于MODEL組(P<0.05)，21、28 d時CLB-H組明顯低于MODEL組，且差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 各組大鼠脛骨Micro-CT的三維圖

第28天各組大鼠脛骨骨折部位ROI區重構圖像(見圖1)發現骨折處MODEL組骨髓腔接近封閉，其余各劑量組完全封閉，說明機體處于骨痂改建期，并且骨損傷處接近正常狀態。由圖2可知，7 d時骨髓區大片無骨小梁。14 d時骨內微結構開始形成，骨小梁稀疏、細小、排列不均。21 d時皮質骨逐漸與骨痂相連，小梁骨逐漸增粗。28 d時骨髓腔逐漸封閉，骨小梁結構緊密，粗細均勻，連續性良好，網狀結構趨于正常的骨組織。綜合上述結果表明各劑量組對骨的修復作用優于模型組。

表1 刺老苞根皮提取物對大鼠骨力學參數的影響Table 1 Effect of aralia echinocaulis extract on rat bone mechanical

注：與模型組比較：*P<0.05。14 d-MODEL為第14天模型組，14 d-CLB-L為第14天刺老苞根皮低劑量組，14 d-CLB-M為第14天刺老苞根皮中劑量組，14 d-CLB-H為第14天刺老苞根皮高劑量組，21 d-MODEL為第21天模型組，21 d-CLB-L為第21天刺老苞根皮低劑量組，21 d-CLB-M為第21天刺老苞根皮中劑量組，21 d-CLB-H為第21天刺老苞根皮高劑量組，28 d-MODEL為第28天模型組，28 d-CLB-L為第28天刺老苞根皮低劑量組，28 d-CLB-M為第28天刺老苞根皮中劑量組，28 d-CLB-H為第28天刺老苞根皮高劑量組。

表2 Micro-CT測定各組大鼠脛骨相關參數的改變Table 2 Changes of tibia microstructural parameters of rats in different

注：與模型組相比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1 第28 d各組大鼠脛骨Micro-CT的三維圖Fig.1 Micro-CT images of different groups at 28 days after the operation

圖2 不同時間點刺老苞根皮高劑量組大鼠脛骨Micro-CT的三維圖Fig.2 Micro-CT images of the high dose group at different time points

3 討論

本實驗利用三點彎曲實驗檢測骨折愈合的機械性能，通過外界作用下使骨組織受力，并檢測其力學性能和產生的生物學效應。可應用于評價藥物對骨相關疾病治療的指標[7,8]。在測試結束后，可以對脛骨的強度、剛度、硬度、韌性和彈性等骨結構力學參數和骨生物力學參數做出評估。通過此實驗結果顯示，從14 d到28 d與模型組相比，中、高劑量組的骨結構力學參數有所提高，并且從14 d到28 d時中、高劑量組的骨生物力學參數也高于模型組。提示內服刺老苞根皮可通過改善骨折部位骨微小結構，提高骨密度，促進骨組織結構完整性，從而提升骨的抗沖擊和變形能力，使其韌性和可塑性增強，骨組織強度增加，使脛骨的結構力學和生物力學性能得以提高。

目前，評價骨折愈合的組織形態學方法很多，骨整合和骨結構則是由組織學和免疫組織化學以二維方式進行，骨量化、結構及礦化則是由Micro-CT斷層掃描以三維方式進行[9-12]。與二維組織學和免疫組織化學技術相比，Micro-CT是無破壞性的技術，并能在體外提供骨骼三維圖像[13]。因此Micro-CT掃描測量分析技術已被廣泛應用于評估生物材料和組織中[14]，通常被作為從宏觀和微觀角度評價骨質量的輔助技術。現已在大量開放性骨折和閉合性骨折實驗中證明Micro-CT掃描技術在分析和評價骨折愈合上具有可靠性。本實驗選擇Micro-CT三維形態參數中BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、SMI作為評價骨折愈合參數。BV/TV是相對骨體積分數；Tb.Th是骨小梁的平均厚度；Tb.N是指給定長度內骨組織與非骨組織的交點數即骨小梁數量；Tb.Sp是指骨小梁之間的髓腔平均寬度，Tb.Sp值的減少提示骨形成的增加；SMI是結構模型指數，用于定義骨小梁板狀和桿狀的程度，板狀骨小梁和桿狀骨小梁的SMI數值分別是0和3。骨組織受損后，骨小梁從板狀向桿狀轉變，SMI數值增加。通過Micro-CT實驗結果提示，與MODEL組相比， BV/TV、Tb.Th、Tb.V在21、28 d時CLB-M組、CLB-H組明顯升高(P<0.05或P<0.01)；Tb.Sp、SMI在21、28 d時，CLB-M組、CLB-H組明顯低于MODEL組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。提示刺老苞根皮能夠使骨體積、骨結構和鏈接密度明顯提高，骨小梁數量和骨小梁厚度增加，從而增加骨密度，達到促進骨折愈合的作用。

由前期實驗[15,16]可推測，刺老苞根皮可能通過促進血管生成，縮短血管重建時間，誘導參與骨折愈合的成纖維細胞、成骨細胞分裂增殖，同時抑制破骨細胞分化，促進骨小梁形成，使骨小梁數量和骨小梁厚度增加，松質骨網狀結構趨于完整。結合生物力學參數結果提示，大鼠脛骨骨結構的韌性得到提高，且作用與刺老苞根皮的劑量呈一定相關性。由于近年來民族藥物資源的開發受到國內外研究學者的關注，刺老苞根皮作為土家族習用草藥，對骨損傷疾病(如骨質疏松、骨折等)有良好的療效，具有很好的開發前景，但其作用機制尚未明確，有待進一步探究，從而更好的為臨床治療提供理論依據和對民族藥物刺老苞根皮的開發進行保護。