中藥葛根素對青年大鼠峰值骨量的影響研究

葸慧榮 李文苑 楊芳芳 馬慧萍 陳克明*

1. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050 2. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050

峰值骨量(peak bone mass, PBM)即骨成熟末期所達到的最大骨量,是人一生中骨礦含量最高、骨硬度最大的時期。研究表明，峰值骨量的高低與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生有密切關(guān)系，峰值骨量越高，越不易發(fā)生骨質(zhì)疏松。因此，努力提高峰值骨量是骨質(zhì)疏松防治的重點[1,2]。葛根素是從中草藥葛根中提取的異黃酮類化合物，化學名為4’，7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮，分子式為C21H20O9[3]。據(jù)報道，葛根具有活血化瘀、改善微循環(huán)、擴張冠狀動脈等作用，其制劑葛根素注射劑臨床用于治療心腦血管疾病及視網(wǎng)膜血管病、眼底病及突發(fā)性耳聾等[4]。近年來，關(guān)于葛根素影響骨代謝的研究越來越受重視，實驗研究表明葛根素在體內(nèi)外實驗中有增加骨量、改善骨代謝、抑制破骨細胞分化、促進成骨細胞生成的作用[5]；許多學者又發(fā)現(xiàn)葛根素提取液可明顯抑制OVX 大鼠的骨吸收率，將骨量維持于接近正常水平[6]。葛根素具有異黃酮結(jié)構(gòu)，其化學結(jié)構(gòu)與雌激素相似，能發(fā)揮雌激素樣效應(yīng)，但較雌激素毒副作用小，幾乎無子宮增生等不良反應(yīng)[7]?；谝陨涎芯?，我們推測葛根素可能會提高生長期大鼠的峰值骨量。因此，本實驗考察了葛根素對青年大鼠峰值骨密度和骨質(zhì)量的影響，同時考察了其安全性，以期對于葛根素的臨床預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

葛根素購自陜西寶雞辰光生物科技有限公司，純度≥98%；淫羊藿苷購自陜西寶雞辰光生物科技有限公司，純度≥98%；雙能X線骨密度儀(Prodigy，GE公司，美國)，萬能材料試驗機(AG-IS，島津公司，日本)，硬組織切片機(SP1600，LEICA公司，德國)，正置熒光顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)，雌二醇、骨鈣素和抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(IDS公司，丹麥)，酶標儀(Epoch,BioTek公司，美國)。

1.2 實驗設(shè)計

1月齡雌性Wistar大鼠36只，體重(114±5)g，SPF級，購自甘肅省蘭州市蘭州大學醫(yī)學院實驗動物中心(實驗動物合格證號：SCXK (甘) 2014-0006-152)。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后按隨機數(shù)表法分為3組，每組12只，分別為對照組(control，CON)、淫羊藿苷組(icariin，ICA，陽性對照)和 葛根素組(puerarin，PR)。 ICA組灌胃淫羊藿苷25 mg/(kg·d)，PR組灌胃葛根素15.4 mg/(kg·d)，CON組灌胃等體積蒸餾水。大鼠飼養(yǎng)于 SPF 級實驗室，飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃，濕度60%～70%，自由攝水和進食，每2周稱1次體重，每個月測1次全身骨密度，待組間骨密度出現(xiàn)顯著性差異后即處死所有動物，逐項開展以下檢測。

1.3 檢測項目

1.3.1體重、器官系數(shù)和病理學分析：所有大鼠自由進水、進食，每周換一次墊料，同時監(jiān)測一次體重。兩月后處死全部大鼠，剝離其主要內(nèi)臟肺、腎、子宮，稱其濕重，計算器官指數(shù)；之后將各器官固定于10%福爾馬林溶液中，兩周后進行石蠟包埋、切片、HE染色，在顯微鏡下觀察病理切片，進行病理學分析。

1.3.2骨密度檢測：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，用雙能X線骨密度儀檢測全身骨密度，當發(fā)現(xiàn)組間有顯著性差異后即處死所有動物，分離出椎骨和右側(cè)股骨，分別置檢查床上檢測其骨密度值。

1.3.3生物力學分析[8]：股骨進行三點彎曲試驗，置于AG-IS型萬能試驗機，跨距14 mm，加載速度10 mm/min，計算機記錄載荷變形曲線及最大載荷、彈性模量和屈服強度等。第四腰椎骨(L4)用于壓縮試驗，將椎體兩面的椎間盤及軟組織切除，用砂紙將椎骨打磨成上下兩個面平行的圓柱體，將圓柱體垂直放置于不銹鋼平臺上，逐漸加載壓力，加載速度為2 mm/min，記錄載荷變形曲線及最大載荷、彈性模量等。

1.3.4血清生化指標檢測：采用腹主動脈取血法抽取血樣，5 000 r/min，離心10 min，取上層血清，-80 ℃保存；按ELISA試劑盒的說明書制作OC，TRACP 5b標準曲線，并分別于450 nm和405 nm處測定OD值，通過標準曲線計算出含量。

1.3.5股骨VG染色分析：新鮮分離的左側(cè)脛骨用4%多聚甲醛固定后，參考胡蘊玉主編的《骨科實驗技術(shù)》[9]進行脫水包埋，將包埋好的骨組織用LEICA SP1600鋸式切片機切成約50 μm的骨片，用502膠水將骨片封固于載玻片上，用1200～2000目砂紙打磨至顯微鏡下可見的厚度，進行VG染色。即將打磨好的切片超聲潤洗10 min，0.1%甲酸浸泡3 min，2%甲醇浸泡2 h，流水沖洗3 min，亞甲基藍60 ℃水浴5～8 min，水洗至不褪色，苦味酸品紅染色15 min，無水乙醇沖洗數(shù)秒，二甲苯透明2～3 min，完成染色。鏡下觀察骨組織形態(tài)并通過Image-Pro Plus 6.0軟件進行量化分析,量化分析指標包括定量分析包括骨體積/組織體(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)。

1.4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計分析均采用SPSS 17.0軟件完成，所有檢測數(shù)據(jù)表示均用均數(shù)±標準差，不同組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD檢驗法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重、臟器系數(shù)及病理學檢測結(jié)果

實驗過程中，各組大鼠飲食、飲水量及精神狀態(tài)無明顯變化，隨時間增長兩組大鼠體重均增加，但無統(tǒng)計學差異(表1)；臟器系數(shù)結(jié)果顯示，與CON組比較，ICA組和PR組大鼠主要器官肺、腎、子宮的臟器系數(shù)無統(tǒng)計學意義(表2)，病理學觀察也無明顯毒副作用(圖1)。

表 1 大鼠體重變化結(jié)果Table 1 Changes in the body weight of

注： 與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CON組相比，#P<0.05，##P<0.01

表2 大鼠主要器官的器官指數(shù) Table 2 The organ index of main organs in

注： 與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CON組相比，#P<0.05，##P<0.01

圖1 大鼠主要臟器病理切片的HE染色(20×)Fig.1 Histopathological sections of rats were stained with HE (20×)

2.2 骨密度檢測結(jié)果

如表3所示，灌胃給藥前，CON組、 ICA組和PR組大鼠全身骨密度均無統(tǒng)計學意義，灌胃4 w時，與CON組比較， ICA組和PR組大鼠全身骨密度有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；灌胃8 w時ICA組和PR組大鼠骨密度顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。實驗大鼠處死后立即剝離椎骨和左側(cè)股骨，檢測其離體骨密度，結(jié)果出現(xiàn)與全身骨密度相同的趨勢，即與CON組相比，ICA組和PR組股骨離體骨密度均顯著升高(P均<0.01)， 椎骨離體骨密度均顯著升高(P均<0.05)(表4)，這表明連續(xù)灌胃給予葛根素兩個月后大鼠骨密度較空白對照組顯著提高。

組別0 w4 w8 wCON0.1212±0.003150.135±0.002820.154±0.00187 ICA0.1211±0.01010.139±0.003140.163±0.00295? PR0.1219±0.01150.137±0.001310.161±0.00139#

注： 與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CON組相比，#P<0.05，##P<0.01

組別股骨椎骨CON0.116±0.001250.118±0.00143 ICA0.123±0.0010??0.126±0.00278? PR0.126±0.00198##0.128±0.00214#

注： 與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CON組相比，#P<0.05，##P<0.01

圖2 大鼠脛骨近端不脫鈣切片VG染色 (4×)Fig.2 The VG staining results of undecalcified sections of tibial epiphysis (4×)

2.3 生物力學結(jié)果

股骨三點彎曲試驗和椎骨壓縮試驗顯示，與CON組相比，ICA組和PR組大鼠股骨和最大載荷值顯著升高(P均<0.01)，彈性模量值也顯著升高(P均<0.05，)(表5)；與CON組相比，ICA組和PR組大鼠椎骨和最大載荷值顯著升高(P均<0.05)，彈性模量值也顯著升高(P均<0.05)(表6)。

2.4 大鼠骨形態(tài)計量學分析結(jié)果

如圖2所示，與CON組相比，ICA組和 PR組脛骨的骨小梁數(shù)目顯著增加，骨小梁分離度明顯減低，連續(xù)性較好；各項量化指標出現(xiàn)相同趨勢，即與CON組相比，ICA組和PR組股骨中骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨體積/組織體積(BV/TV)值均顯著升高，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，而骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)(圖3)。

組別最大載荷(N)彈性模量(N/mm2)CON70.90±6.638663.80±1021.46 ICA120.37±3.17??11442.57±576.07? PR129.56±5.09##11586.57±632.74#

注：與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CON組相比，#P<0.05，##P<0.01

組別最大載荷(N)彈性模量(N/mm2)CON240.60±9.26299.20±17.85 ICA292.14±12.06?521.43±40.53? PR288.31±14.37#440.87±82.02#

注：與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CON組相比，#P<0.05，##P<0.01

圖3 大鼠脛骨近骺端組織計量學靜態(tài)參數(shù)比較結(jié)果Fig.3 Comparison of static histomorphometric parameters in tibial epiphysis of 注：與CON組相比，*P<0.05,**P<0.01;與CON組相比，#P<0.05,##P<0.01

2.5 對大鼠血清 OC, TRACP 5b含量的影響

如表7所示，與CON組比較，ICA組和PR組OC含量值顯著升高(P均<0.05)，而TRACP 5b含量顯著降低(P均<0.05)，表明中藥葛根素能促進大鼠血清中成骨細胞分泌因子OC含量，降低破骨細胞分泌因子TRACP 5b的含量。

組別OC(ng/mL)TRACP 5b(U/L)CON145.37±55.442.98±1.70 ICA223.42±42.47?1.08±2.23# PR214.17±39.97#1.52±0.30#

注：與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CON組相比，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨量丟失、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞,導致骨脆性增加和骨強度下降,并易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病,是最常見的代謝性骨病之一[10]。骨質(zhì)疏松癥由峰值骨量和年齡增長相關(guān)的骨丟失兩方面決定的，任何年齡段的骨量則是成熟期PBM與骨丟失量之差[11]。青年時期PBM值的高低對老年時期的骨量有至關(guān)重要的作用,是決定老年期是否發(fā)展為骨質(zhì)疏松癥的重要因素，老年期的低骨量主要是由于年輕時的低峰值骨量造成的，PBM的形成受遺傳因素的控制和環(huán)境因素的影響。不同個體的PBM相差較大,其中60%～80%是由遺傳因素決定，20%～40%則是由環(huán)境因素如運動、鈣攝入、生活方式、身體疾病狀態(tài)等決定,年輕成人時獲得的最大PBM是預(yù)防老年性骨折的根本性措施[12,13]。因此，從青年時期開始增加骨骼質(zhì)量，提高青少年時期峰值骨量已成為預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的有效方法之一。

本實驗以葛根素為實驗藥物，灌胃劑量參考公認治療骨質(zhì)疏松癥的藥物金雀異黃酮劑量10 mg/kg[14]，將其換算成同樣摩爾濃度的淫羊藿苷和葛根素，即25 mg/(kg·d)和15.4 mg/(kg·d)劑量對大鼠灌胃給藥8 w，實驗過程中，實驗組大鼠的進食量、進水量和體重與對照組無統(tǒng)計學意義。主要臟器肝臟、腎、子宮等濕重和器官系數(shù)均無明顯差別，病理學觀察也未見異常變化。表明口服淫羊藿苷和葛根素8 w對大鼠飲食無不良影響，也未產(chǎn)生明顯毒副作用。但大鼠給藥8 w后其全身骨密度明顯增加，股骨和椎骨骨密度也明顯高于對照組。血清OC 和TRACP 5b 的檢測結(jié)果表明，葛根素可顯著地提高OC水平；同時，降低了TRACP 5b含量，提示葛根素提高青年大鼠峰值骨量可能是通過提高骨形成，抑制骨吸收來實現(xiàn)的。骨生物力學研究內(nèi)容主要包括股骨三點彎曲試驗和椎骨壓縮實驗，其評價指標通常為骨最大載荷、彈性模量和屈服強度等，上述參數(shù)可直接反應(yīng)其抗骨折能力。而骨形態(tài)計量學是對骨組織微結(jié)構(gòu)的重要評價。本實驗生物力學結(jié)果顯示，實驗組股骨和椎骨最大載荷值和彈性模量均顯著高于對照組，表明葛根素可提高青年大鼠股骨和椎骨的力學性能和強度。骨形態(tài)計量學VG染色圖及量化結(jié)果顯示，葛根素能顯著增加實驗大鼠股骨中骨小梁的數(shù)目，增加骨小梁厚度，同時減少骨小梁分離度，從而改善骨微結(jié)構(gòu)。

目前，葛根素預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的報道較多，黃彤等[15]證明葛根素對卵巢切除和睪丸切除的動物骨骼有保護作用，能改善骨密度，促進骨形成。孫蓓蓓等[16]證實葛根素可促進體外成骨細胞的生長和功能，抑制骨吸收。而本實驗證明葛根素能顯著提高生長期大鼠的骨密度和骨生物力學，提高血清中骨形成因子含量，抑制骨吸收因子水平。葛根素作為臨床應(yīng)用藥物主要用于治療高血壓、冠心病心絞痛等疾病，但在骨質(zhì)疏松癥上的應(yīng)用并不廣泛，還需要做大量的臨床研究。本實驗研究為葛根素的臨床應(yīng)用提供了一定依據(jù)，在防治骨質(zhì)疏松癥方面進行了新的探討。