不同低氧對大鼠肺、主動脈平滑肌細胞增殖的影響

摘要：目的 研究不同低氧對大鼠肺動脈平滑肌細胞（PASMCs ）、主動脈平滑肌細胞（AASMCs ）增殖的影響。方法 將原代培養的大鼠肺、主動脈平滑肌細胞分為對照組常氧（21% O2，74% N2，5% CO2 ）、實驗組低氧（15%O2 ，85% N2，5% CO2） ；（10% O2，85% N2，5% CO2） ；（5% O2，90% N2，5% CO2） ；（3% O2，92% N2，5% CO2），培養48h后通過細胞胞計數和WST-1法測定肺、主動脈平滑肌細胞的增殖并分析差異性。結果 表明PASMCs 在各個低氧濃度下均能發生增殖反應，而在10% O2、5% O2、3% O2條件下與對照相比具有呈著性差異（P<0.01）；（AASMCs ）在3% O2條件下可發生增殖反應且與對照相比呈著性差異（P<0.01）。結論 大鼠PASMCs和AASMCs對不同低氧濃度的敏感度不同。

關鍵詞：主動脈平滑肌細胞 肺動脈平滑肌細胞 低氧 增殖

低氧性肺動脈高壓（HPH）是高原低氧及慢性阻塞性肺疾患發展成為肺源性心臟病的關鍵環節。HPH在高原地區較常見，但是很少發生低氧性主動脈，造成這樣現象的機制目前還不清楚。HPH的主要病理變化以肺動脈收縮反應增強及肺血管結構重建為主要特征。血管的重構主要是動脈平滑肌細胞（ASMCs）的增殖，ASMCs增殖主要受血管外周微環境的影響，即肺泡氧分壓。高壓人體呈健康狀態時，肺血管所處的周圍肺組織中氧分壓是105 mmHg，而體循環血管所處的周圍組織器官氧分壓一般低于40 mmHg。因此，本實驗旨在從細胞水平探討不同低氧對大鼠PASMCs、AASMCs增殖的影響。

一、材料與方法

（一） 材料

雄性 200 g SD 大鼠，由空軍軍醫大學動物室提供；胎牛血清（Hyclone），非必需氨基酸（Hyclone），DMEM高糖培養液（Hyclone），胰酶（Hyclone），wst-1 （碧云天）、其余試劑為國產分析純試劑。

主要儀器為三氣細胞培養箱 （Heraeus）；酶標儀（VERSAmax）；倒置相差顯微鏡（Nikon）。

（二） 方法

1.原代細胞培養

麻醉約200 g雄性SD大鼠，分離股動脈和肺內第二、三級肺動脈，將分離的中層動脈條浸于10% DMEM中5min后，離心管中切碎，將沉淀后的組織塊均勻地種于培養瓶，加含有20%胎牛血清的DMEM培養基，置于95%空氣和5%CO2的培養箱中培養3-4h，再輕輕地翻轉培養瓶，絕對靜止培養3天。實驗采用3-5代的PASMCs和AASMCs。

2.細胞增殖實驗

分別用胰酶消化PASMCs和AASMCs，用血細胞計數板計數并種于96孔板，密度為5×103細胞，常氧環境下（21%O2），貼壁培養24h。用含5%血清的DMEM饑餓處理24h后，分別放置于15%O2、10%O2、5%O2和3%O2的低氧環境以及21%O2的常氧環境，培養48h后，采用Wst-1在450 nm下測細胞的吸光度OD值，Wst-1的使用方法見使用說明書（碧云天）。

3. 統計學分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件進行分析。

二、結果

（一） 增殖結果

各低氧組PASMCs，培養第1天時，增殖緩慢，到第2天時迅速開始增殖，比常氧組明顯增多，48h測OD值發現，在10% O2、5% O2、3% O2處理條件下PASMCs與對照相比具有呈著性差異（P <0.01），而在15%O2處理條件下，無顯著性差異；低氧組AASMCs在15% O2、10% O2和5% O2處理條件下生長速度與常氧對照組一致，而在3% O2條件下可發生增殖反應且與對照相比呈著性差異（P<0.01），其余低氧條件下均無顯著性差異。結果表明細胞水平PASMCs比AASMCs對低氧更敏感。PASMCs與AASMCs的生長曲線如圖1。

三、結語

PASMCs和AASMCs經過15% O2、10% O2、5% O2和3% O2一系列低氧處理后，在15% O2濃度時，PASMCs已發生增殖反應，但AASMCs不發生增殖反應，當氧濃度下降到3%時，AASMCs發生增殖反應，二者均發生增殖反應，表明細胞水平PASMCs比AASMCs對低氧更敏感。我們認為，可能由于血管所處周圍氧環境差異所致，肺血管長期處于富氧環境中，而體循環血管長期處于低氧環境中，Han JA 報也道在低氧3% O2通過抑制平滑肌細胞eNOS活性，加強大鼠股深動脈的收縮，提示肺動脈與股動脈對低氧反應的本質是一致的，只是發生低氧性血管收縮時的氧分壓不同而已，支持了主、肺動脈平滑肌細胞對低氧的敏感度不同這一觀點。

參考文獻：

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（作者簡介：魏琪，碩士，西安培華學院 助教，研究方向：蛋白材料的制備及活性研究。）