乳腺癌細(xì)胞中microRNA作用機(jī)制的系統(tǒng)生物學(xué)分析

謝忠偉 李普民 王進(jìn)

乳腺癌是女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，病因尚未完全清楚。現(xiàn)在已知的乳腺癌易感基因有BRCA1和BRCA2等[1]。microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的約22 nt的RNA，通過(guò)結(jié)合在基因的3’UTR抑制基因的表達(dá)，大量癌癥研究表明，miRNA在癌癥發(fā)生過(guò)程中起到重要作用[2]。與傳統(tǒng)的針對(duì)單個(gè)基因的研究模式不同，系統(tǒng)生物學(xué)的方法試圖考慮到生物體內(nèi)多個(gè)基因之間的交互作用，避免以偏概全的局限性，從而揭示生物系統(tǒng)背后復(fù)雜的機(jī)制。本研究對(duì)人乳腺上皮細(xì)胞（HMEC）和乳腺癌細(xì)胞（MCF7）采用了RNA-seq技術(shù)篩選出差異表達(dá)的miRNA和基因，結(jié)合miRNA對(duì)基因的靶向關(guān)系，構(gòu)建差異miRNA與基因的調(diào)控關(guān)系，進(jìn)而分析差異表達(dá)基因參與的信號(hào)通路，從系統(tǒng)層面上了解乳腺癌細(xì)胞中的基因調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及RNA提取

HMEC和MCF7購(gòu)買于ATCC平臺(tái)，細(xì)胞按照ATCC要求進(jìn)行培養(yǎng)，用Trizol方法提取細(xì)胞中的總RNA。

1.2 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建使用的是NEB產(chǎn)品（E7645S），由北京百邁客生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 miRNA測(cè)序分析

去除測(cè)序數(shù)據(jù)中包含接頭序列、質(zhì)量值低于20及長(zhǎng)度大于30、低于18的序列。利用miRDeep2（https：//github.com/rajewsky-lab/mirdeep2）軟件獲得成熟miRNA的表達(dá)情況，將變化倍數(shù)大于2的miRNA作為差異表達(dá)miRNA。成熟的miRNA數(shù)據(jù)下載于miRBase21（http：//www.mirbase.org/）。

1.4 基因測(cè)序分析

去除測(cè)序數(shù)據(jù)中包含接頭序列、質(zhì)量值低于20及長(zhǎng)度低于30的序列。利用TopHat軟件（https：//ccb.jhu.edu/software/tophat/manual.shtml）將clean reads比對(duì)到參考基因組上，再用cufflink套件（http：//cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/）進(jìn)行差異分析，將變化倍數(shù)大于2且P值小于0.01的基因作為差異表達(dá)基因。參考基因組序列信息及基因注釋文件均下載于Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp：//ftp.ensembl.org/pub/）的hg38最新版本。

1.5 miRNA與基因的調(diào)控關(guān)系構(gòu)建

差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)使用Tarbase[3]。從預(yù)測(cè)結(jié)果中提取在HMEC和MCF7中差異表達(dá)且與miRNA表達(dá)變化負(fù)相關(guān)的基因。Hub基因取Top10高度值的節(jié)點(diǎn)。

1.6 通路富集分析

使用R包c(diǎn)lusterProfiler（https：//github.com/GuangchuangYu/clusterProfiler）對(duì)差異miRNA調(diào)控的基因進(jìn)行通路富集分析，設(shè)定P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNA分析

MCF7相比HMEC共發(fā)現(xiàn)456個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)表達(dá)217，下調(diào)表達(dá)239。

2.2 差異表達(dá)基因分析

MCF7相比HMEC共發(fā)現(xiàn)4 566個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)2 710，下調(diào)表達(dá)1 856。

2.3 調(diào)控關(guān)系分析

結(jié)合差異表達(dá)miRNA的靶基因信息，獲得表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)的348個(gè)miRNA和2 223個(gè)基因，共16 554條調(diào)控關(guān)系，構(gòu)成miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)度分布示于圖1A，接近scale-free網(wǎng)絡(luò)。圖1B是hub節(jié)點(diǎn)構(gòu)成的子網(wǎng)絡(luò)，hsa-miR-19a-3p與hsa-miR-30c-5p等hub miRNA在乳腺癌細(xì)胞中主要是通過(guò)靶向POU2F和CBX5等hub基因起作用。

2.4 通路富集分析

2 223個(gè)被差異miRNA調(diào)控的基因共富集到64條通路上，最顯著的前5條通路分別是PI3K-Akt信號(hào)通路、人乳頭狀瘤病毒感染、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)粘連、癌癥蛋白聚糖和MAPK信號(hào)通路。

3 討論

圖1 差異miRNA與靶基因的調(diào)控關(guān)系分析

乳腺癌作為女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開(kāi)始就一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是目前病因尚未完全清楚。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，在癌癥的發(fā)生過(guò)程中起到重要的作用。系統(tǒng)生物學(xué)從生物系統(tǒng)的角度揭示復(fù)雜的機(jī)制，利用系統(tǒng)生物學(xué)的方法分析基因和miRNA在癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，有助于分析癌癥的發(fā)病機(jī)制。

本研究對(duì)HMEC和MCF7采用了RNA-seq技術(shù)篩選出差異表達(dá)的456個(gè)miRNA和4 566個(gè)基因，文獻(xiàn)中被報(bào)導(dǎo)過(guò)的易感基因BRCA1與BRCA2[1]均顯著上調(diào)，與乳腺癌密切相關(guān)的miR-221/222[4]也發(fā)生顯著變化。篩選出表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)的348個(gè)miRNA和2 223個(gè)基因，得到在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的hub基因和hub miRNA。此外還構(gòu)建了共16 554條調(diào)控關(guān)系，構(gòu)成miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)度分布接近scale-free網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)觀察hub節(jié)點(diǎn)構(gòu)成的子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-19a-3p與hsa-miR-30c-5p等hub miRNA在乳腺癌細(xì)胞中主要是通過(guò)靶向POU2F和CBX5等hub基因起作用。2 223個(gè)被差異miRNA調(diào)控的基因共富集到64條通路上，最顯著的前5條通路分別是PI3K-Akt信號(hào)通路、人乳頭狀瘤病毒感染、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)粘連、癌癥蛋白聚糖和MAPK信號(hào)通路。其中，眾多研究表明PI3K-Akt通路與腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]；細(xì)胞基質(zhì)粘連在細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控以及細(xì)胞生存方面發(fā)揮了不可或缺的作用[6]；蛋白聚糖成為癌癥治療的靶標(biāo)和標(biāo)記物[7]。hub基因中CDK6參與其中PI3k-Akt、p53等15條通路，有研究表明，CDK6一般在癌細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，是癌癥與疾病生成的重要標(biāo)記物，并且被廣泛用來(lái)作為藥物作用靶點(diǎn)[8]。

綜上所述，hsa-miR-19a-3p與hsa-miR-30c-5p等hub miRNA靶向CBX5和POU2F等hub基因與乳腺癌的生成密切相關(guān)；PI3K-Akt與細(xì)胞基因粘連等通路在乳腺癌的基因調(diào)控機(jī)制中起著重要作用。