人腦膠質瘤培養組織對化療藥物的敏感性

徐立新,張 偉,師忠芳,董麗萍,閆 旭,袁 芳

腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，臨床采用手術、放療和化療的綜合治療，有效化療是延長術后腦膠質瘤患者生命的必要手段之一[1]。但由于血腦屏障和腫瘤耐藥現象的存在，化療藥物的療效仍然不盡如人意[2]，術后腦膠質瘤患者選擇適合的化療藥物對提高療效、減輕不良反應有重要意義。本研究用體外藥敏檢測法比較了腦膠質瘤標本對臨床5種常用化療藥的敏感性，并分析了其與患者病理分級的相關性；電鏡觀察了膠質瘤敏感藥物標本的超微結構，對作用機制進行初步探討，為術后膠質瘤患者選擇合適的化療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 112例標本選自2013-01至2015-12北京天壇醫院腦膠質瘤患者手術切除的腦膠質瘤組織。男74例，女38例；年齡12～71歲，平均(42.95±11.79)歲；初發97例，復發15例。按照WHO腦膠質瘤分類標準：Ⅱ級53例，Ⅲ級20例，Ⅳ級39例。

1.2 試劑 組織塊培養液為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液。化療藥物尼莫司汀(ACNU)、順鉑(DDP)、替莫唑胺(TMZ)、長春新堿(VCR)、替尼泊甙(VM26)五種單獨用藥及DDP+VM26組合用藥，所試驗藥物濃度均為血漿峰濃度，分別為0.7、0.25、0.5、2.0、0.05 mg/ml。

1.3 組織培養藥敏檢測法 根據文獻[2]的方法進行實驗。手術當日取無污染組織標本，切割成1 mm3大小的組織塊，放置于有濾紙的24孔培養板中，加入組織塊培養液300 μl，37 ℃ 、5%CO2培養箱中孵育。第2天用江蘇先聲藥業有限公司開發的TECIA(tissue culture-end point staining- computer image analysis, TECIA)圖像分析系統測定組織塊面積(area, A)，然后除對照孔外，每孔加入化療藥物3 μl，112例標本除觀察5種化療藥外，其中88例增加組合用藥DDP+VM26，在培養箱繼續孵育72 h后，每孔組織塊上加10 μl MTT溶液(10 mg/ml)，繼續孵育4 h后用TECIA圖像分析系統測定組織藍染面積(blue area, BA)，TECIA分析軟件計算化療藥物抑制率(IR)，IR={1-[(BA處理/A處理)/(BA對照/A對照)]×100%。 對照為同一標本未用化療藥物作用的腦膠質瘤組織。參照Singh等[3]研究，以抑制率作為評價化療藥物敏感性標準，抑制率在30%以上為敏感，低于30%為耐藥。

1.4 透射電鏡觀察 選擇藥物抑制率較高的標本，用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定2 h，再用1%鋨酸固定2 h，環氧丙烷置換后Epon812包埋，制備1 μm半薄切片，天青-美蘭染色后在光學顯微鏡下定位，制備40 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛染色，PHILIPS EM208s透射電鏡下觀察。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.5 for Windows統計軟件，腦膠質瘤標本對化療藥敏感性比較、病理分級與各種藥物敏感性之間的相關性分析采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 藥物敏感性比較 112例標本對化療藥物敏感性見表1。PDP+VM26敏感性最高，達40.9%。

2.2 透射電鏡觀察結果 為觀察化療藥物作用下腫瘤細胞變化，選擇對藥物敏感性較高的標本，利用透射電鏡觀察腫瘤組織的超微結構變化。 對照組可見腫瘤細胞結構基本正常，藥物組可見腫瘤細胞呈現不同程度的凋亡晚期改變(如質膜完整、細胞器密集、核染色質斑塊狀凝聚、邊集、呈典型新月體樣)，或壞死改變(如裸核多見、質膜崩解、細胞器溶解、核染色質凝聚、溶解，圖1)。

表1 人腦膠質瘤組織對化療藥物敏感性的比較

注：χ2=49.740,P<0.001；ACNU，尼莫司??；DDP，順鉑； VCR，長春新堿；TMZ，替莫唑胺；VM26，替尼泊甙

圖1 透射電鏡替尼泊甙與順鉑組合用藥作用后腦膠質瘤組織的超微結構變化

A.對照組為未用化療藥物作用的腦膠質瘤組織，腫瘤細胞結構基本正常(×8000)；B.藥物組腫瘤細胞呈壞死改變(×10000)；C.藥物組腫瘤細胞呈凋亡晚期改變(×6000)；D.藥物組凋亡腫瘤細胞，核染色質呈典型新月體樣凝聚(×16000)

2.3 病理分級與化療藥敏感性的關系 將112例患者按WHO膠質瘤分類標準進行惡性度分級，并與各種藥物的敏感性進行比較，經χ2檢驗，只有DDP+VM26組合用藥的敏感性與患者的病理分級有關(P<0.05)，其他五種單藥敏感性與患者的病理分級差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 腦膠質瘤細胞病理分級與各種藥物敏感性的關系

3 討 論

神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的顱內惡性腫瘤，惡性程度高，臨床影像學缺乏特異性[4]，治療強調以手術、放療、化療為主的綜合治療，其中化療是腦膠質瘤治療的重要環節[5]。然而，由于腫瘤的異質性及不同腫瘤類型或同一腫瘤類型的不同個體對化療藥物藥敏性不同，自20世紀60年代用化療藥治療腦膠質瘤以來，治療效果不盡人意。因此，了解不同患者對不同化療藥物的敏感和耐受情況，為臨床選擇適合的化療藥有一定的指導意義。

本研究中組織培養藥敏檢測法參照立體組織培養法(histoculture drug response assay, HDRA)[6]，利用TECIA圖像分析系統，檢測了112例腦膠質瘤標本對臨床使用的治療惡性腦腫瘤的5種化療藥物的敏感性，發現對同一藥物不同患者間敏感性差異較大，同一個體對不同藥物的敏感性也存在差異，結果顯示各種化療藥物敏感比例的大小依次為DDP+VM 26、VM26、TMZ、VCR、DDP和ACNU。這與國內學者利用單細胞的MTT法進行腦膠質瘤體外藥敏檢測的結果相似[7]，張驚宇等[8]應用CCK-8法進行化療藥物的敏感性測定也得到了相似的結果，表明該實驗方法具有一定的穩定性和重復性。本研究對患者病理分級是否影響藥物敏感性進行了相關性分析，結果顯示只有DDP+VM26組合用藥的敏感性與患者的病理分級有關，這與張偉等[2]研究結果一致，以上結果提示對膠質瘤患者實施個體化治療是非常必要的。

大量研究顯示，化療藥物之所以能達到抗腦膠質瘤的作用，主要是通過直接或間接破壞DNA、抑制蛋白質合成等不同機制發揮作用[9]，在本研究中筆者通過透射電鏡觀察各種化療藥物作用后膠質瘤組織的超微結構變化，發現對照組腫瘤細胞結構基本正常，而給藥組腫瘤細胞呈現不同程度的凋亡或壞死改變，表明化療藥物可能是通過引起腫瘤細胞凋亡或壞死發揮抑瘤作用。徐榮等[10]通過流式細胞儀檢測的方法證實VM26在膠質瘤細胞化療過程中誘導細胞凋亡效果顯著。除了細胞凋亡和壞死，化療藥物作用后細胞是否存在其他的死亡方式，例如脹亡、自噬、焦亡等形式，值得我們進一步深入研究。

研究結果顯示，VM26抑瘤作用較強。李巖等[11]研究發現VM-26聯合DDP對復發高級別膠質瘤，無論耐藥基因O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methyl-guanine DNA methyltransferase, MGMT)啟動子是否甲基化均有較好的療效，曹廣輝等[12]研究也發現，應用VM26聯合甲基環亞硝脲聯合化療，能有效地控制手術切除和放療后MGMT陽性的對TMZ耐藥的低級別膠質瘤患者的腫瘤生長，在本研究中我們也發現DDP+VM26組合用藥的敏感性較高，這些研究結果為腦膠質瘤患者的化療提供了新的選擇。

本研究結果充分說明腦膠質瘤患者對不同化療藥物的敏感性存在明顯的個體差異, 同一種藥物對不同腦膠質瘤患者作用也存在差異。研究結果提示化療前對腦膠質瘤患者進行個體化化療敏感性試驗是必要的, 可以避免盲目用藥, 提高治療效果。近些年來出現的分子病理檢測對腦膠質瘤患者的化療也提供了一定幫助，如果能把體外藥敏檢測和分子病理檢測結合起來，可能會對膠質瘤患者化療有更大幫助。