復方公英散對大鼠宮腔粘連組織IL-8及TNF-a表達的影響

劉 敏，趙大鵬，吳興國，王詠梅

（山東省泰安市中心醫院，山東 泰安 271000）

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）亦稱阿是曼綜合征（Asherman syndrome），于1894年由Fritsch首次報道［1］，明確定義其為子宮內膜基底層損傷后修復障礙導致宮腔部分或全部粘連閉塞，常伴發月經異常、周期性腹痛、不孕及反復流產等臨床表現［2］。目前，宮腔粘連的發病機制尚未明確，子宮內膜基底層的損傷被認為是導致宮腔粘連的關鍵因素［3］，炎癥介導的子宮內膜的損傷也在宮腔粘連的發病機制中起著決定性的作用［4］。白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）與腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor-a，TNF-a）是近年來研究較多的與炎癥發病相關的因子。IL-8與TNF-a兩者特異性結合，在炎癥細胞的黏附、滲出、侵襲、增殖等過程中發揮重要的生物學作用。有研究發現，宮腔粘連患者纖維化內膜及病灶周圍組織中，均有IL-8和TNF-a的表達，且纖維化內膜組織中的表達明顯高于正常內膜組織，說明IL-8、TNF-a在子宮內膜纖維化的發生、發展過程中起一定作用［5］。

本課題通過RT-PCR的檢測方法測定IL-8及TNF-a在大鼠宮腔粘連組織中的表達，探討IL-8及TNF-a在大鼠子宮纖維化內膜中的表達及觀察復方公英散對其表達的影響，為闡明宮腔粘連的發病機制及復方公英散的推廣使用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物健康成熟未曾交配過的雌性SD大鼠45只，體質量250～280g，購自山東大學附屬齊魯醫院實驗動物中心（動物使用許可證SCXK魯2017-0001）。自然光照，常規飼養。

實驗藥物復方公英散來源于泰安市中心醫院婦科臨床經驗方。由蒲公英30g，赤芍20g，丹皮20g，薏苡仁30g，三七粉6g，白芷10g，紅藤20g，桂枝15g，連翹15g，甘草10g組成，經提取精制而成。

1.2 方法

動物模型：采用非動情期刮宮法建立大鼠宮腔粘連模型［6］，建模在無菌操作下進行。消毒備皮區皮膚，腹腔注射水合氯酵麻醉，取下腹正中縱切口，尋找雙側子宮。取一側子宮，于子宮分叉右上方行切口，盡量避開血管，刮勺搔刮右宮腔，當搔刮子宮四壁感覺粗糙時，停止刮宮。

分組給藥：SD雌性大鼠30只，按照上述造模方法制作大鼠宮腔粘連動物模型。造模7天后隨機分為模型組和復方公英散組各15只，每只動物每天灌胃1次，每組均連續給藥28天。具體分組和給藥劑量如下：①空白組用生理鹽水；②模型組用生理鹽水；③復方公英散組用復方公英散0.4g/mL。以上各組均按每天每100g體質量1mL計算給藥。

標本獲取：各組大鼠于末次給藥24h內行大鼠脫臼猝死開腹，取各組正常子宮內膜和纖維化內膜組織，放入液氮并轉入-80℃冰箱。

1.3 RT-PCR

采用RT-PCR法檢測各組內膜組織中IL-8及TNF-a mRNA的表達（逆轉錄試劑盒和RNA 提取試劑購自山東騰云生物科技有限公司）。引物設計：IL-8上游引物5'-CATGGATCTGTCGTAGGGCT-3'，下游引物5'-CTGACCAACAGACCAGGGTT-3'；TNF-α上游引物5'-ATGGTCACCCTCAGATCAGC-3'，下游引物5'-TTGACCGCTGAA GAG ACCCT-3'；GAPDH上游引物5' -ATGTTTGTGATG GGCGTG AACC-3'，下游引物5'-CCCAGCATCGAAGGTAGAGGA-3'。反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s；IL-8 55℃退火30s；TNF-α58℃退火30s；72℃延伸30s，共35個循環；72℃最后延伸7min。

2 結 果

模型組大鼠纖維化內膜組織與空白組正常子宮內膜組織中IL-8 mRNA的表達比較差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組及正常子宮內膜組織均有表達TNF-a mRNA，分別為3.004±0.264、0.360±0.421，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。給藥28天后，治療組內膜組織IL-8 mRNA表達下降，與模型組及空白組比較，差異均有統計學意義；治療組TNF-mRNA的表達下降，與模型組及空白組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 模型組及空白組中IL-8mRNA、TNF--a mRNA表達比較 （±s）

表1 模型組及空白組中IL-8mRNA、TNF--a mRNA表達比較 （±s）

組別 例 mRNA IL-8 TNF-a模型組 10 2.861±0.427 3.004±0.264空白組 10 0.216±0.043 0.360±0.421治療組 10 0.646±0.264 0.587±0.476

3 討 論

宮腔粘連是由于宮腔操作術中沖任胞宮，胞脈受金屬器械所傷，離經瘀血形成。患者濕熱內襲，蘊于下焦，若術后起居失宜、攝生不慎，外邪襲內，入于胞中，與瘀搏結，以致閉經；或術前即有生殖系統感染，術后發作，此時濕熱淚結滯于胞絡之間，便形成纖維粘連。濕、熱、瘀血是宮腔粘連的主要病理基礎，可類比于現代醫學之“炎癥反應”與“纖維化病變”：炎癥反應屬于早期發病階段，此時由于濕與熱困阻于胞絡，粘連較少或尚未形成，但局部炎性缺氧缺血狀態己經形成，為粘連的形成創造了環境基礎。到炎性反應末期，濕熱與瘀血搏結，瘢痕化形成，發生內膜纖維化改變，腔鏡下觀察粘連帶呈機化，白色索狀粘連。

現代醫學研究認為，白細胞介素多在炎癥反應中作用廣泛，也可調節免疫機能。IL-8屬于C-X-C亞家族，其來源于如中性粒細胞、血管內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞等等，是一種庭化性細胞因子，可激化活嗜中性粒細胞，具有調節免疫和炎癥反應的作用［7］。腫瘤壞死因子－a（TNF-a）可產生炎癥介質，參與炎癥反應，調節免疫機能，是一種促炎因子［8］。TNF-a在創傷修復過程中會促發成纖維細胞增生，促進傷口愈合。子宮內膜受到損傷后的愈合過程與傷口愈合類似。因此推測IL-8、TNF-a與宮腔粘連具有相關性。

復方公英散是趙錫民教授根據宮腔粘連“濕熱淚結”的病機，遵循辨證與辨病相結合的原則，謹守病機特點，兼容自己多年之潛心研究而成。該方采用顆粒劑型，藥物組成包括蒲公英、赤芍、丹皮等，具有活血化瘀、清熱滲濕之功效。臨床研究表明，復方公英散可抑制子宮內膜纖維化病灶的生長，減少閉經等癥狀，且在宮腔鏡治療宮腔粘連術后有抑制其復發作用。基于以上，本研究觀察大鼠子宮內膜組織中IL-8、TNF-a表達，發現大鼠纖維化內膜組織的表達高于正常子宮內膜組織。而且復方公英散可影響宮腔粘連組織IL-8、TNF-a的表達，說明復方公英散對大鼠子宮內膜纖維化的治療作用可能與抑制IL-8、TNF-a的表達有一定關系。通過本研究為進一步探討宮腔粘連的發病機制及復方公英散的治療作用和推廣使用提供了理論依據。