青稞核糖體蛋白基因HbRPL19的克隆、序列分析及原核表達

徐齊君，扎 桑，王玉林，原紅軍，曾興權(quán)，尼瑪扎西

(1. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)研究所,西藏 拉薩 850002; 2. 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室,西藏 拉薩 850002; 3. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院,西藏 拉薩 850002)

【研究意義】青稞(HordeumvulgareL. var. nudum HK.f.)為禾本科大麥屬，又名裸大麥、米大麥，為藏族人民主要糧食作物。青稞主要生長在海拔高、溫度低、日照長、晝夜溫差大的地區(qū)，對環(huán)境的抗逆性較強[1]。近些年來，研究者們先后對青稞的抗鹽性[2-3]、抗旱性[4-5]等方面進行了研究，以期明確青稞的抗逆機制，篩選出有應用價值的基因，為提高青稞的產(chǎn)量和質(zhì)量，選育出抗逆性強的優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。【本研究切入點】在前期研究中，采用轉(zhuǎn)錄組測序和抑制性差減雜交技術(shù)對青稞的抗寒相關(guān)基因進行了篩選，其中，核糖體蛋白基因RPL19(GeneBank登錄號: AK361587)位列其中[6]。【前人研究進展】核糖體蛋白主要有70S和80S 2種類型，70S存在于細菌、線粒體和葉綠體中，分50S和30S 2個亞基；80S核糖體存在于真核生物的細胞質(zhì)中，分60S和40S 2個亞基[7]。研究表明，核糖體蛋白除組成核糖體參與蛋白質(zhì)合成外，還通過參與復制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復等作用于細胞的分裂、增殖、分化、發(fā)育調(diào)控等多種生命過程[8-10]。【擬解決的關(guān)鍵問題】對得到的青稞RPL19基因的初步分析顯示，該基因編碼一個50S葉綠體核糖體蛋白。為進一步了解該基因的相關(guān)信息，以青稞為材料，進行RPL19基因的克隆、序列分析及原核表達，旨在為進一步了解RPL19的功能，明確其與青稞的抗寒相關(guān)性方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞種質(zhì)‘喜馬拉雅8號’和‘青稞320’由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 青稞種苗轉(zhuǎn)錄本的提取及反轉(zhuǎn)錄 取適量的青稞種子播種于富含有機質(zhì)的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長至正常大小時，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit提取新鮮葉片RNA，采用TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit進行反轉(zhuǎn)錄，cDNA樣本-20 ℃保存。

1.2.2HbRPL19基因的克隆 以轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異引物RPL19-F：5′- ATTGCGGGATCCATGCAGTCTTTAGTGC -3′，RPL19-R：5′- ATCTCGCTCGAGTCAT TTCTTGAGTGCATTC -3′，下劃線分別為BamH I和XhoI酶切位點。RT-PCR反應在S-1000 Thermal Cycler進行，反應體系采用20 μl PCR擴增體積：TaqDNA聚合酶(TaKaRa，5 U/μl) 0.2 μl，10×PCR反應緩沖液(Takara) 2 μl，dNTP(10 mmol/L)1.6 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，cDNA 2 μl，滅菌水12.6 μl。反應條件：94 ℃變性4 min，94 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34循環(huán)；72 ℃延伸10 min。回收目標片段，克隆、測序。

1.2.3HbRPL19基因的生物信息學分析 利用NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)、ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、DISPHOS(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)、InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)、Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、PredictProtein(https://ppopen.rostlab.org/)、NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)等網(wǎng)絡(luò)資源對HbRPL19進行序列分析。根據(jù)推測的HbRPL19氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件進行氨基酸序列同源性比對和進化樹分析。

1.2.4 原核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 挑選測序正確的陽性克隆提質(zhì)粒，采用BamHI和XhoI分別雙酶切陽性重組質(zhì)粒和表達質(zhì)粒pET-28a(+)，凝膠回收目標片段，使用T4DNA連接酶與16 ℃連接過夜，挑單克隆震蕩培養(yǎng)后提質(zhì)粒，酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒。將鑒定正確的陽性質(zhì)粒pET28a-RPL19轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，同時將提取的空載體pET-28a(+)轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21(DE3)作陽性對照，BL21(DE3)感受態(tài)細胞不轉(zhuǎn)化組作陰性對照。

1.2.5 蛋白的誘導及檢測 分別挑單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含Kan 100 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時，取1 mL按1∶100比例接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中；將培養(yǎng)的100 mL培養(yǎng)液分為2份，其中1份加IPTG誘導表達，另1份不加IPTG作為對照，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8 h。取IPTG誘導后菌液1 mL，離心，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌后，加入100 μl生理鹽水及5×SDS上樣緩沖液25 μl，100 ℃煮沸10 min，離心，取上清進行SDS-PAGE。對未誘導菌液做同樣處理，觀察表達情況。同時將LB液體培養(yǎng)未轉(zhuǎn)化及空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化的BL21作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbRPL19基因的克隆

以電子克隆延伸得到的序列(GeneBank登錄號: AK361587)為基礎(chǔ)設(shè)計特異引物，擴增青稞苗期葉片的cDNA，獲得1個條帶654 bp的cDNA序列(圖1)，測序分析顯示該片段為預期的HbRPL19基因CDS全長。

圖1 HbRPL19基因擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of HbRPL19

2.2 HbRPL19基因的序列分析

用ORFfinder在線分析顯示，HbRPL19基因CDS全長654 bp，編碼1個217個氨基酸的多肽(圖2)。ProtParam分析表明，HbRPL19基因編碼的多肽相對分子質(zhì)量為24.47 KD，理論等電點(pI)為10.42，分子式為C1082H1791N327O302S8，總平均親水性(GRAVY)為-0.353，不穩(wěn)定系數(shù)為53.46，編碼的217個氨基酸中，包括21個帶負電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)，40個帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)，其余氨基酸為非極性、疏水性氨基酸和極性、中性氨基酸，表明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。Disphos預測表明，HbRPL19存在29個磷酸化位點(包括12個絲氨酸磷酸化位點，13個蘇氨酸磷酸化位點和4個酪氨酸磷酸化位點)，其中，只有1個絲氨酸磷酸化位點有功能(第86個氨基酸)。應用InterProScan和NCBI網(wǎng)站的Conserved domains分析顯示，HbRPL19蛋白存在典型的SH3-like結(jié)構(gòu)域和核糖體蛋白L19結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖2 HbRPL19基因的CDS序列和推測氨基酸序列Fig.2 CDS and amino acid sequence of HbRPL19

圖3 HbRPL19蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Domain analysis of HbRPL19 protein

圖4 HbRPL19的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Systematic evolutionary analysis of HbRPL19

TMHMM預測該蛋白不含跨膜轉(zhuǎn)移功能區(qū)。Signal IP3.0 預測該蛋白沒有信號肽，不屬于分泌蛋白。PredictProtein亞細胞定位證實該基因所編碼蛋白位于葉綠體內(nèi)。

Blastn分析發(fā)現(xiàn)，HbRPL19基因序列與山羊草、二穗短柄草、小米和高粱等植物的RPL基因全長cDNA序列相似度分別為94 %、87 %、85 %和84 %，推導的氨基酸序列同源比對分析結(jié)果表明，該基因與小麥、山羊草、二穗短柄草、水稻、小米等植物相似度分別為94 %、93 %、82 %、74 %、72 %。基于氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹表明，青稞HbRPL19蛋白(GeneBank登錄號：BAJ87120)與小麥和山羊草具有較近的親緣關(guān)系(圖4)。

NPS二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，72個氨基酸屬于α螺旋，占33.18 %；50個氨基酸為延伸鏈，占23.04 %；19個氨基酸屬于β折疊，占8.76 %；76個氨基酸屬于無規(guī)則卷曲，占35.02 %。應用SWISS-MODEL建立該蛋白的三級結(jié)構(gòu)，如圖5 所示。

2.3 HbRPL19基因的原核表達

利用BamH I和XhoI雙酶切重組質(zhì)粒，結(jié)果切出的片段與預期大小相同(圖6a)，進一步的測序分析顯示，HbRPL19插入片段完全正確，未發(fā)生任何堿基突變。將重組質(zhì)粒導入BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導8 h后收集菌體進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示融合蛋白誘導成功，與預期大小(24.47 KD)相近，融合蛋白主要存在于菌體沉淀中，上清中含量極少(圖6b)，表明得到的HbRPL19誘導蛋白主要以包涵體形式存在。

3 討 論

中國國土面積遼闊，地形復雜，培育適于各種極端環(huán)境條件且高產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)的農(nóng)作物是我們持之以恒的目標。青稞可以在青藏高原高海拔高寒的極端條件下生長良好，對環(huán)境有優(yōu)良的適應性，同時青稞自身具有一定的保健價值。因此，對于青稞這一特殊種植資源的利用具有很大的價值。同時，由于青稞屬禾本科，研究其遺傳背景對于選育高產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)抗寒的農(nóng)作物具有重要意義。

a中h:α螺旋，e:延伸鏈，t: β折疊，c:無規(guī)則卷曲h: alpha helix, e: extended strand, t: beta turn, c: random coil圖5 HbRPL19蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測Fig.5 Prediction of secondary structure and tertiary structure of HbRPL19 protein

圖6 pET28a-RPL19重組質(zhì)粒的雙酶切和重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 Double digestion of recombinant plasmid pET28a-RPL19 and SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

葉綠體核糖體是植物特有的細胞器核糖體，主要功能是作為一個平臺，在這個平臺上，mRNA，tRNA和各種蛋白合成因子相繼組裝，來執(zhí)行譯碼和催化肽鏈的合成，負責著質(zhì)體基因編碼的不到100個蛋白的合成。葉綠體核糖體由30 S和50 S兩個亞基構(gòu)成，包含rRNA和50～100種獨特的蛋白[7]。在組成和行使功能的方式上，葉綠體核糖體與細菌的70 S核糖體非常相似，大部分葉綠體核糖體蛋白在大腸桿菌核糖體中都可以找到同源蛋白，其大約有45 %的平均序列一致性[11-12]。目前，葉綠體核糖體中rRNAs已經(jīng)被完全確定，核糖體蛋白的功能也逐漸開始了相關(guān)研究[13-19]。顧志敏等[20]首次從單子葉的模式植物水稻中克隆了核糖體蛋白質(zhì)S7基因，證明核糖體蛋白質(zhì)在進化過程中的高度保守性。Yao等[21]成功分離了小麥中的15個核糖體蛋白質(zhì)基因，并分析了其序列特性并進行了表達模式的檢測。本研究克隆得到的青稞HbRPL19屬于葉綠體核糖體50 S亞基的組成蛋白，其功能尚不清楚。我們在采用轉(zhuǎn)錄組測序和抑制性差減雜交技術(shù)對青稞的抗寒相關(guān)基因進行篩選的過程中發(fā)現(xiàn)，HbRPL19包含其中，推測其與青稞的抗寒性相關(guān)。因此，對HbRPL19基因進行了進一步的克隆和序列分析，同時，進行了原核表達，探究其在體外的表達情況。

4 結(jié) 論

在本研究中，我們成功獲得了青稞HbRPL19基因CDS全長序列及其編碼蛋白，為進一步研究HbRPL19蛋白與其它葉綠體內(nèi)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。