高效液相色譜法同時測定人參藥材中的6種人參皂苷含量

商曉慧 朱亞楠 葉冠

摘 要 目的：參照全球主要國家藥典的相關內容，應用高效液相色譜法建立更趨簡便、實用的人參皂苷含量測定方法。方法：采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm）；流動相為0.025%磷酸溶液-乙腈，梯度洗脫；流速0.9 ml/min；檢測波長203 nm。對10批市售人參藥材中的6種人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd的含量進行測定。結果：可同時測定6種人參皂苷含量。10批市售人參藥材中的6種人參皂苷含量的差異較大。結論：本方法專屬性強，且測定結果準確、可靠，可用作人參藥材質量標準中人參皂苷含量的測定方法。

關鍵詞 人參 人參皂苷 高效液相色譜法 含量測定

中圖分類號：R927.2； R284.1 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）13-0072-04

SHANG Xiaohui**， ZHU Yanan， YE Guan***

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the determination of six ginsenosides on the basis of ChP 2015， USP38-NF33， EP8.0， BP 2013 and JP17. Methods： The contents of six ginsenosides in ten samples sold in market were determined by HPLC on a ZORBAX Eclipse Plus C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5.0 mm） with a mobile phase of acetonitrile-0.025% of phosphoric acid solution （adjusted to pH 2 with phosphoric acid） at the flow rate of 0.9 ml/min and the detected UV wavelength of 203 nm. Results： The contents of six ginsenosides including Rg1， Re， Rf， Rb1， Rb2 and Rd in the ten samples could be simultaneously determined and there were significant differences among them. Conclusion： This method is simple， rapid and repeatable with good specificity， so it can be used for quality control of Panax ginseng.

KEY WORDS Panax ginseng； ginsenosides； HPLC； content determination

人參（Panax ginseng C. A. Mey.）為五加科植物人參的干燥的根和根莖，具有“百草之王”的美譽，具有補益脾肺、生津養血、安神益智等多種功效[1]，多用于大補元氣。現代藥理研究表明，人參由于其多成分、多靶點的作用，具有改善心血管循環、提高免疫力、延緩衰老和抗腫瘤等多種藥理活性[2-5]。

人參具有較高的保健、藥用價值，在全球范圍內得到了廣泛應用。目前，全球主要國家藥典中均收載有人參藥材的質量標準，且多以人參皂苷Rg1、Rb1和Re的含量為指標進行質量控制。

為了更好地控制人參藥材質量，筆者等在參照各主要國家藥典相關內容、特別是《2015美國藥典-國家處方集》中西洋參質量標準的基礎上，應用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）建立了可同時測定人參藥材中6種主要人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd含量的新方法，為人參藥材企業內控標準的建立提供了依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜系統（美國Agilent公司生產）；乙腈（色譜純）、磷酸（分析純）、水（超純水）。

10批市售人參藥材（經筆者之一葉冠鑒定為人參的干燥根，樣品保存在筆者所在研究院的樣本庫中）。

對照品人參皂苷Rg1（批號：110703-201230）、Re（批號：110754-201525）、Rf（批號：111719-201505）、Rb1（批號：110704-201424）、Rb2（批號：111715-201203）和Rd（批號：111818-201302）均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法及結果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取適量人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd，甲醇定容后得濃度分別為2 620、2 250、1 200、3 340、1 610和1 420 μg/ml的對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備

方法1：取供試品粉末（過4號篩）約3 g，精密稱定后溶于150 ml三氯甲烷中，采用索氏提取法加熱回流3 h，棄三氯甲烷液，殘渣待溶劑揮發后移入250 ml錐形瓶中，加150 ml水飽和正丁醇，超聲處理90 min，過濾。取濾液125 ml，蒸干，殘渣以甲醇溶解并移至25 ml量瓶中，定容，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

方法2：取供試品粉末（過4號篩）約3 g，精密稱定后溶于150 ml甲醇中，超聲處理90 min，過濾。濾液濃縮至25 ml，定容，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

對方法1所得供試品溶液進行HPLC測定，算得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積分別為982.39、595.27、263.14、452.23、122.08和57.19；對方法2所得供試品溶液進行HPLC測定，算得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積分別為837.65、502.76、168.33、321.98、98.56和36.23。使用方法2所得供試品溶液測得的人參皂苷含量偏低，且色譜峰的峰形較差。因此，本研究使用方法1制得的供試品溶液。

2.3 色譜條件及系統適用性試驗

采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm），以0.025%磷酸溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫（0 ～ 35 min，19%乙腈；35 ～ 55 min，19% ～ 29%乙腈；55 ～ 70 min，29%乙腈；70 ～ 100 min，29% ～ 40%乙腈），流速0.9 ml/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μl，檢測波長203 nm。

在上述色譜條件下進行HPLC測定，對照品溶液和人參藥材樣品溶液的色譜圖見圖1。從圖1可知，各人參皂苷色譜峰的峰形、分離度均良好，無干擾峰，表明系統的適用性良好。

2.4 線性關系考察

將6種人參皂苷的對照品溶液分別稀釋5、10、20、50、80和100倍，以0.22 μm濾膜過濾后再分別吸取10μl進行HPLC測定。以濃度為橫坐標（x）、色譜峰的峰面積為縱坐標（y）繪制各人參皂苷成分的標準曲線，線性回歸后得回歸方程，結果見表1。從表1可知，各人參皂苷成分在各自線性范圍內的線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取由“修正”人參制得的供試品溶液，連續進樣6次進行HPLC測定，計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，它們的RSD分別為2.44%、2.48%、1.15%、2.81%、1.67%和2.23%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取“秘參堂”人參粉末6份，分別為3.032 4、3.011 7、3.039 8、3.020 3、3.023 4和3.002 5 g，按“2.2”項下方法1制備供試品溶液，進樣進行HPLC測定，計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，它們的平均含量分別為2.080、1.731、0.498、1.093、0.331和0.157 mg/g，RSD分別為1.38%、1.61%、1.17%、1.96%、1.38%和1.94%，表明方法的重復性良好。

2.7 穩定性試驗

精密吸取由“修正”人參制得的供試品溶液并分別于制備后0、2、4、8、12和24 h進樣進行HPLC測定，計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，它們的RSD分別為2.25%、2.02%、1.54%、3.62%、2.83%和2.14%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的人參粉末6份約各1.01 g，加入一定量的對照品溶液，按“2.2”項下方法1制備供試品溶液，進樣進行HPLC測定，計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，然后采用外標法計算加樣回收率。

加樣回收率（%）=（C-A）/B×100%

其中，A為供試品所含被測成分量，B為加入的對照品量，C為實測值。

各人參皂苷的平均加樣回收率和RSD見表2。

2.9 耐用性試驗

考察不同色譜柱溫（25、30和35 ℃）條件下進行HPLC測定時各人參皂苷色譜峰峰面積的變化情況，算得的各人參皂苷色譜峰的峰面積和RSD見表3。

2.10 樣品含量測定結果

分別取10批市售人參藥材，按“2.2”項下方法1制備供試品溶液，進樣進行HPLC測定，計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，然后采用外標法計算它們在人參藥材中的含量，結果見表4。

由表4可見，10批市售人參藥材中的6種人參皂苷含量及合計含量差異較大，其中Rg1含量范圍在0.139 ～0.244 g/100 g間；Re含量范圍在0.124 ～ 0.190 g/100 g間；Rf含量范圍在0.030 ～ 0.061 g/100 g間；Rb1含量范圍在0.109 ～ 0.139 g/100 g間；Rb2含量范圍在0.031 ～ 0.076 g/100 g間；Rd含量范圍在0.005 ～ 0.042 g/100 g間。6種人參皂苷的合計含量范圍在0.463 ～ 0.627 g/100 g間。

3 討論

人參是名貴中藥材，應用廣泛。2012年衛生部發文公布批準人工種植的人參為新資源食品，明確了≤5年的人工種植人參在我國可用于食品的生產與加工。但市售的不同來源人參的活性成分含量差異較大[6]，為確保成品品質的穩定，有必要對人參藥材的質量進行更全面的控制。

全球主要國家藥典均以人參皂苷Rg1、Rb1和Re等的含量對人參藥材進行質量控制。《2015美國藥典-國家處方集》中規定，西洋參干藥材中的6種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd的總含量不得<4.0%。本研究參照全球主要國家藥典的相關內容，應用HPLC建立可同時測定人參藥材中6種主要人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd含量的新方法，以用于更全面地控制人參藥材的質量。

《2015美國藥典-國家處方集》西洋參質量標準中采用3 μm的色譜柱填料測定6種人參皂苷含量，對實驗室設備條件的要求很高，難以用作生產企業的常規質量檢查手段。《歐洲藥典8.0》和《英國藥典2013》中采用5 μm的色譜柱填料測定人參皂苷，但方法的專屬性不好。本研究采用常規的5 μm色譜柱，通用性好，可同時對人參藥材中6種主要人參皂苷進行含量測定。

食品開發注重色、香、味、形。用作食品原料的人參藥材，其感官指標要求具有人參特有的香氣以及味甘、微苦，但缺乏量化標準。本研究在人參藥材企業內控質量標準的建立過程中，通過對市售10批人參藥材進行感官評審、人參皂苷含量測定等系統研究發現，人參藥材的滋味與本研究HPLC測定方法測得的6種人參皂苷的總含量呈正相關關系，但與應用紫外-可見分光光度計法（國家標準GB/T 19506）測得的總人參皂苷無相關性，推測原因可能是紫外-可見分光光度計法缺乏專一性，從而導致結果差異較大。因此，為保證人參相關食品的感官與功效，應建立或更新企業的人參藥材內控質量標準，采用本研究建立的HPLC測定方法同時測定人參藥材中的6種主要人參皂苷含量。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（2015年版，一部）[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2015： 8-9.

[2] 羅林明， 石雅寧， 姜懿納， 等. 人參抗腫瘤作用的有效成分及其機制研究進展[J]. 中草藥， 2017， 48（3）： 582-596.

[3] 孫瑩瑩， 劉玥， 陳可冀. 人參皂苷的心血管藥理效應：進展與思考[J]. 中國科學：生命科學， 2016， 46（6）： 771-778.

[4] 陳文學， 楊銘， 于德偉， 等. 人參糖肽對糖尿病氣陰兩虛證大鼠降血糖作用及其機制研究[J]. 中國藥學雜志， 2014， 49（21）： 1903-1907.

[5] Wong AS， Che CM， Leung KW. Recent advances in ginseng as cancer therapeutics： a functional and mechanistic overview[J]. Nat Prod Rep， 2015， 32（2）： 256-272.

[6] 李慧， 許亮， 溫美佳， 等. 不同產地人參皂苷成分含量UPLC法測定及質量評價[J]. 中華中醫藥雜志， 2015， 30（6）： 1963-1968.