高效液相色譜法同時(shí)測定人參藥材中的6種人參皂苷含量

商曉慧 朱亞楠 葉冠

摘 要 目的：參照全球主要國家藥典的相關(guān)內(nèi)容，應(yīng)用高效液相色譜法建立更趨簡便、實(shí)用的人參皂苷含量測定方法。方法：采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm）；流動(dòng)相為0.025%磷酸溶液-乙腈，梯度洗脫；流速0.9 ml/min；檢測波長203 nm。對(duì)10批市售人參藥材中的6種人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd的含量進(jìn)行測定。結(jié)果：可同時(shí)測定6種人參皂苷含量。10批市售人參藥材中的6種人參皂苷含量的差異較大。結(jié)論：本方法專屬性強(qiáng)，且測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用作人參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中人參皂苷含量的測定方法。

關(guān)鍵詞 人參 人參皂苷 高效液相色譜法 含量測定

中圖分類號(hào)：R927.2； R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）13-0072-04

SHANG Xiaohui**， ZHU Yanan， YE Guan***

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the determination of six ginsenosides on the basis of ChP 2015， USP38-NF33， EP8.0， BP 2013 and JP17. Methods： The contents of six ginsenosides in ten samples sold in market were determined by HPLC on a ZORBAX Eclipse Plus C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5.0 mm） with a mobile phase of acetonitrile-0.025% of phosphoric acid solution （adjusted to pH 2 with phosphoric acid） at the flow rate of 0.9 ml/min and the detected UV wavelength of 203 nm. Results： The contents of six ginsenosides including Rg1， Re， Rf， Rb1， Rb2 and Rd in the ten samples could be simultaneously determined and there were significant differences among them. Conclusion： This method is simple， rapid and repeatable with good specificity， so it can be used for quality control of Panax ginseng.

KEY WORDS Panax ginseng； ginsenosides； HPLC； content determination

人參（Panax ginseng C. A. Mey.）為五加科植物人參的干燥的根和根莖，具有“百草之王”的美譽(yù)，具有補(bǔ)益脾肺、生津養(yǎng)血、安神益智等多種功效[1]，多用于大補(bǔ)元?dú)狻，F(xiàn)代藥理研究表明，人參由于其多成分、多靶點(diǎn)的作用，具有改善心血管循環(huán)、提高免疫力、延緩衰老和抗腫瘤等多種藥理活性[2-5]。

人參具有較高的保健、藥用價(jià)值，在全球范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。目前，全球主要國家藥典中均收載有人參藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且多以人參皂苷Rg1、Rb1和Re的含量為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制。

為了更好地控制人參藥材質(zhì)量，筆者等在參照各主要國家藥典相關(guān)內(nèi)容、特別是《2015美國藥典-國家處方集》中西洋參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）建立了可同時(shí)測定人參藥材中6種主要人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd含量的新方法，為人參藥材企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司生產(chǎn)）；乙腈（色譜純）、磷酸（分析純）、水（超純水）。

10批市售人參藥材（經(jīng)筆者之一葉冠鑒定為人參的干燥根，樣品保存在筆者所在研究院的樣本庫中）。

對(duì)照品人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-201230）、Re（批號(hào)：110754-201525）、Rf（批號(hào)：111719-201505）、Rb1（批號(hào)：110704-201424）、Rb2（批號(hào)：111715-201203）和Rd（批號(hào)：111818-201302）均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法及結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取適量人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd，甲醇定容后得濃度分別為2 620、2 250、1 200、3 340、1 610和1 420 μg/ml的對(duì)照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備

方法1：取供試品粉末（過4號(hào)篩）約3 g，精密稱定后溶于150 ml三氯甲烷中，采用索氏提取法加熱回流3 h，棄三氯甲烷液，殘?jiān)軇]發(fā)后移入250 ml錐形瓶中，加150 ml水飽和正丁醇，超聲處理90 min，過濾。取濾液125 ml，蒸干，殘?jiān)约状既芙獠⒁浦?5 ml量瓶中，定容，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

方法2：取供試品粉末（過4號(hào)篩）約3 g，精密稱定后溶于150 ml甲醇中，超聲處理90 min，過濾。濾液濃縮至25 ml，定容，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

對(duì)方法1所得供試品溶液進(jìn)行HPLC測定，算得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積分別為982.39、595.27、263.14、452.23、122.08和57.19；對(duì)方法2所得供試品溶液進(jìn)行HPLC測定，算得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積分別為837.65、502.76、168.33、321.98、98.56和36.23。使用方法2所得供試品溶液測得的人參皂苷含量偏低，且色譜峰的峰形較差。因此，本研究使用方法1制得的供試品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm），以0.025%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0 ～ 35 min，19%乙腈；35 ～ 55 min，19% ～ 29%乙腈；55 ～ 70 min，29%乙腈；70 ～ 100 min，29% ～ 40%乙腈），流速0.9 ml/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μl，檢測波長203 nm。

在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC測定，對(duì)照品溶液和人參藥材樣品溶液的色譜圖見圖1。從圖1可知，各人參皂苷色譜峰的峰形、分離度均良好，無干擾峰，表明系統(tǒng)的適用性良好。

2.4 線性關(guān)系考察

將6種人參皂苷的對(duì)照品溶液分別稀釋5、10、20、50、80和100倍，以0.22 μm濾膜過濾后再分別吸取10μl進(jìn)行HPLC測定。以濃度為橫坐標(biāo)（x）、色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制各人參皂苷成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸后得回歸方程，結(jié)果見表1。從表1可知，各人參皂苷成分在各自線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取由“修正”人參制得的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行HPLC測定，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，它們的RSD分別為2.44%、2.48%、1.15%、2.81%、1.67%和2.23%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取“秘參堂”人參粉末6份，分別為3.032 4、3.011 7、3.039 8、3.020 3、3.023 4和3.002 5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法1制備供試品溶液，進(jìn)樣進(jìn)行HPLC測定，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，它們的平均含量分別為2.080、1.731、0.498、1.093、0.331和0.157 mg/g，RSD分別為1.38%、1.61%、1.17%、1.96%、1.38%和1.94%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取由“修正”人參制得的供試品溶液并分別于制備后0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣進(jìn)行HPLC測定，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，它們的RSD分別為2.25%、2.02%、1.54%、3.62%、2.83%和2.14%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的人參粉末6份約各1.01 g，加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法1制備供試品溶液，進(jìn)樣進(jìn)行HPLC測定，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，然后采用外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率。

加樣回收率（%）=（C-A）/B×100%

其中，A為供試品所含被測成分量，B為加入的對(duì)照品量，C為實(shí)測值。

各人參皂苷的平均加樣回收率和RSD見表2。

2.9 耐用性試驗(yàn)

考察不同色譜柱溫（25、30和35 ℃）條件下進(jìn)行HPLC測定時(shí)各人參皂苷色譜峰峰面積的變化情況，算得的各人參皂苷色譜峰的峰面積和RSD見表3。

2.10 樣品含量測定結(jié)果

分別取10批市售人參藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法1制備供試品溶液，進(jìn)樣進(jìn)行HPLC測定，計(jì)算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積，然后采用外標(biāo)法計(jì)算它們?cè)谌藚⑺幉闹械暮浚Y(jié)果見表4。

由表4可見，10批市售人參藥材中的6種人參皂苷含量及合計(jì)含量差異較大，其中Rg1含量范圍在0.139 ～0.244 g/100 g間；Re含量范圍在0.124 ～ 0.190 g/100 g間；Rf含量范圍在0.030 ～ 0.061 g/100 g間；Rb1含量范圍在0.109 ～ 0.139 g/100 g間；Rb2含量范圍在0.031 ～ 0.076 g/100 g間；Rd含量范圍在0.005 ～ 0.042 g/100 g間。6種人參皂苷的合計(jì)含量范圍在0.463 ～ 0.627 g/100 g間。

3 討論

人參是名貴中藥材，應(yīng)用廣泛。2012年衛(wèi)生部發(fā)文公布批準(zhǔn)人工種植的人參為新資源食品，明確了≤5年的人工種植人參在我國可用于食品的生產(chǎn)與加工。但市售的不同來源人參的活性成分含量差異較大[6]，為確保成品品質(zhì)的穩(wěn)定，有必要對(duì)人參藥材的質(zhì)量進(jìn)行更全面的控制。

全球主要國家藥典均以人參皂苷Rg1、Rb1和Re等的含量對(duì)人參藥材進(jìn)行質(zhì)量控制?！?015美國藥典-國家處方集》中規(guī)定，西洋參干藥材中的6種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd的總含量不得<4.0%。本研究參照全球主要國家藥典的相關(guān)內(nèi)容，應(yīng)用HPLC建立可同時(shí)測定人參藥材中6種主要人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd含量的新方法，以用于更全面地控制人參藥材的質(zhì)量。

《2015美國藥典-國家處方集》西洋參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用3 μm的色譜柱填料測定6種人參皂苷含量，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件的要求很高，難以用作生產(chǎn)企業(yè)的常規(guī)質(zhì)量檢查手段?！稓W洲藥典8.0》和《英國藥典2013》中采用5 μm的色譜柱填料測定人參皂苷，但方法的專屬性不好。本研究采用常規(guī)的5 μm色譜柱，通用性好，可同時(shí)對(duì)人參藥材中6種主要人參皂苷進(jìn)行含量測定。

食品開發(fā)注重色、香、味、形。用作食品原料的人參藥材，其感官指標(biāo)要求具有人參特有的香氣以及味甘、微苦，但缺乏量化標(biāo)準(zhǔn)。本研究在人參藥材企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立過程中，通過對(duì)市售10批人參藥材進(jìn)行感官評(píng)審、人參皂苷含量測定等系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，人參藥材的滋味與本研究HPLC測定方法測得的6種人參皂苷的總含量呈正相關(guān)關(guān)系，但與應(yīng)用紫外-可見分光光度計(jì)法（國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19506）測得的總?cè)藚⒃碥諢o相關(guān)性，推測原因可能是紫外-可見分光光度計(jì)法缺乏專一性，從而導(dǎo)致結(jié)果差異較大。因此，為保證人參相關(guān)食品的感官與功效，應(yīng)建立或更新企業(yè)的人參藥材內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用本研究建立的HPLC測定方法同時(shí)測定人參藥材中的6種主要人參皂苷含量。

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