熱休克蛋白A12B對缺血/再灌注損傷心肌微血管內皮完整性的保護作用

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷涉及多種機制,而內皮細胞損傷是其中關鍵機制之一。心肌I/R損傷可破壞內皮細胞屏障功能,增加血管通透性,從而加重炎癥反應和增加I/R后心肌無復流現象[1]。熱休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)已被證實高表達于內皮細胞中,并且與血管生成相關[2]。課題組前期已闡明HSPA12B對心肌I/R損傷具有保護作用[3],但其具體機制及其對心臟血管內皮的影響還需進一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用8～10周齡雄性HSPA12B轉基因鼠(HSPA12B Transgenic,Tg)[3]為實驗組(n=12),同窩生雄性野生型鼠(wild type,WT)為對照組(n=12)。所用實驗動物均飼養于南京大學動物模式所SPF級動物房。

1.2 實驗方法

1.2.1 I/R模型:小鼠用1.5%～2%異氟烷吸入麻醉后,開胸,結扎心臟冠脈左前降支,45 min后解除結扎為再灌注開始[4]。所有實驗組和對照組小鼠均接受心臟I/R手術。

1.2.2 再灌注期間心肌微血管血流檢測:心肌I/R開始時,用25μL FITC標記的番茄血凝素直接從靜脈注入小鼠體內。血流重建30 min后,取心臟,每組4只,用OCT包埋制成冰凍組織塊,在心臟乳頭肌水平用切片機切成5μm橫切片,防熒光淬滅劑避光封片,熒光顯微鏡觀察復流面積。

1.2.3 伊文斯蘭滲透實驗:用來評價血管的通透性。心肌I/R開始時,按照3.2μg/g小鼠體質量從靜脈向小鼠體內注射伊文斯蘭染料,每組5只。I/R 30 min后,用冰的1%多聚甲醛(0.05 mol/L檸檬酸緩沖液溶,pH=3.5)從左心室灌注沖洗冠狀動脈網,直至右心室流出的灌注液澄清;分離心臟,拍照。心室組織用甲酰胺在60 ℃條件下震蕩溶解24 h;離心、取上清讀吸光度(610 nm)定量滲漏的伊文斯蘭量。伊文斯蘭滲漏量用吸光度/g 心肌組織表示。

1.2.4 血管內皮結構功能的完整性:每組3只，心臟組織切成1 mm2小塊,2.5%戊二醛固定過夜,0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗,1%鋨酸固定液固定 2 h,脫水、包埋、固化,用超微切片機切成60～70 nm超薄切片,200目銅網搜集,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,采用透射電子顯微鏡觀察。

1.3 統計學分析 數據采用GraphPad Prism 6進行分析,結果以均數±標準差表示,2組間比較采用t檢驗,P<0. 05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HSPA12B減少再灌注期間微血管的無復流現象 如圖1所示:I/R 30 min后,與WT鼠相比,Tg鼠心肌的無復流面積顯著減少[(4.2±0.9)%比(14.9±3.3)%,P<0.05]。

2.2 HSPA12B降低了I/R損傷引起的血管高通透性 I/R 30 min后,WT和Tg鼠伊文斯蘭滲漏量吸光度分別為0.52/mg心室肌組織和0.36/mg心室肌組織。與WT鼠相比,Tg鼠心臟微血管的滲透性降低了29.5%(P<0.05)。

2.3 HSPA12B保護心肌I/R損傷后的血管內皮結構功能的完整性 如圖2所示：I/R損傷后WT鼠心臟內皮細胞收縮,細胞間裂隙形成,內皮細胞從基底膜脫落;而這些現象在Tg鼠中并未觀察到。

3 討論

血管在一段時間短暫缺血后近端動脈再次充分開放而微血管的不完全或不均勻的再灌注稱為無復流現象[5]。I/R后微血管的無復流現象是心肌I/R損傷的基本機制。早在1966年就有學者通過動物實驗證實心肌I/R損傷后會出現心臟微血管無復流現象[7]。

圖1 I/R 30 min后WT鼠與Tg鼠心肌微血管的再灌注FITC(番茄血凝素標記)檢測(n=4)

注:WT鼠:→內皮細胞間裂隙形成;* 內皮細胞損傷;Tg鼠:→內皮細胞間連接完整;RBC:紅細胞圖2 I/R 4 h后WT鼠與Tg鼠電鏡下心肌血管內皮細胞結構比較

心肌無復流現象可持續4周,并可引起心室壁節段運動功能障礙,心室重構和臨床預后不良[8]。因此減少無復流現象可改善微循環血流量,有效地保護心肌I/R損傷。本實驗表明HSPA12B可減少心臟I/R損傷后再灌注期間的微血管無復流現象,說明HSPA12B可促進I/R損傷后微血管的血流重建。

盡管心肌I/R損傷后微血管的無復流現象病理機制并不清楚,但是內皮細胞損傷、微血管阻塞以及細胞和細胞間質水腫機械性壓迫均可導致I/R損傷引起的微血管無復流現象的發生[5, 9-10]。在本實驗中,我們發現Tg鼠心臟內皮細胞間裂隙形成、內皮細胞損傷以及血管的通透性都顯著減少或降低,這表明HSPA12B可通過多種途徑改善微循環血流量。

內皮細胞完整性的破壞是心肌I/R損傷后常見的病理過程。心肌細胞內皮完整性的破壞可導致血管通透性增高和嗜中性粒細胞浸潤并最終導致心肌細胞的凋亡并損害心肌功能[1,11]。 而嗜中性粒細胞與內皮細胞的黏附是嗜中性粒細胞遷移和浸潤的關鍵步驟,其黏附分子的上調對于嗜中性粒細胞與內皮細胞的結合是至關重要的[12]。雖然本實驗結果顯示，HSPA12B可降低心肌I/R損傷引起的微血管高通透性,維持內皮細胞的完整性,但是嗜中性粒細胞是否參與了這個過程及其黏附分子是否上調仍需要進一步實驗證實。有研究報道，PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活在I/R損傷中有保護作用,但HSPA12B在維持心肌微血管內皮細胞完整性的保護作用機制中是否有PI3K/Akt/mTOR信號通路的參與或其他信號通路的參與仍有待進一步的研究。