caspase-3在不同臨床特征老年結直腸癌中的表達

結直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是一種常見的、嚴重威脅人類生命健康的消化系統惡性腫瘤。在我國,其發病率與死亡率呈逐年上升的趨勢[1]。臨床經驗告訴我們,早發現、早治療可讓CRC病人的手術后5年生存率從50%上升到90%以上[2-3]。因此,如何早發現CRC成為臨床研究的重點。

以往的研究表明,CRC的發生、發展、轉歸與細胞凋亡調控有著密切的關系,細胞凋亡是細胞主動死亡的形式,caspase-3在促進細胞的凋亡中有著重要的作用。許多觸發細胞凋亡的因素均是通過激活caspase-3來降解其酶底物,如多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、DNA裂解因子(DFF)和Lamin B等。研究表明,caspase-3及其底物在CRC中表達降低,并與癌細胞的生長和轉移密切相關[4]。老年人群是CRC的高發人群,因此本研究針對老年CRC病人進行caspase-3的表達檢測,為進一步確定該指標作為老年CRC早期標志物提供依據。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 納入2009年6月至2014年6月期間來我院就診的老年CRC病人184例進行研究。所有病人年齡60～80歲,平均(76.42±10.73)歲,其中男102例,女82例。均為直腸腺癌,TNM分期Ⅰ期 19例,Ⅱa期21例,Ⅱb期32例,Ⅲa期54例,Ⅲb期42例,Ⅳ期16例。根據其分化程度,按broder法分為低分化(高度惡性)91例,中分化(高度惡性)54例,高分化(低度惡性)39例;腫瘤發生部位為上段34例,中段107例,下段43例;浸潤深度T1 19例, T2 34例, T3 75例, T4 56例。本研究采用的血液樣品為病人確診后治療前采集的血液,血液樣品保存在-80 ℃超低溫冰箱中留用。

1.2 入選及排除標準 入選標準:(1)病理學檢查明確為直腸腺癌;(2)年齡60～80歲;(3)未并發其他嚴重疾病。排除并發其他嚴重疾病者。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑:外周血RNA提取試劑盒(購自美國Invigrogen公司);反轉錄試劑盒(購自美國Promega公司);PCR預混料(購自大連TaKaRa生物公司);組織蛋白提取試劑盒(購自上海生工公司);鼠抗人caspase-3抗體、羊抗鼠HRP抗體(購自美國abcam公司);其他試劑均為分析純試劑。

1.3.2 主要儀器:臺式離心機、酶標儀(購自德國Thermo公司);Veriti FAST PCR儀(購自美國ABI公司);DYY-6C型高壓電泳儀,凝膠成像儀(北京六一儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化檢測caspase-3的表達水平:將病人直腸癌組織(手術及結腸鏡下取得的標本)立即送檢驗科,即刻進行蠟塊包埋,然后進行切片,封閉,加入含有終濃度為0.05% Triton X-100的PBS中進行通透,加入用PBS以1∶1000稀釋鼠抗人caspase-3一抗,滴加在載玻片切片的位置上,37 ℃恒溫培養箱中孵育3 h。用PBS溶液輕輕沖洗3次,每次5 min。用PBS以1∶3000的比例稀釋生物素標記的羊抗鼠二抗,滴加在載玻片蠟塊的位置上,室溫或37 ℃恒溫培養箱中孵育1 h。用PBS溶液沖洗載玻片,輕輕沖洗5次,每次5 min。滴加SP(鏈霉親和素-過氧化物酶),37 ℃孵育1 h。用PBS溶液沖洗載玻片,輕輕沖洗5次,每次5 min。使用DAB顯色試劑盒進行顯色,使用中性樹膠封片。結果判定:以胎盤細胞胞漿或細胞周圍棕黃色為陽性染色,每張切片選擇5個高倍視野,計數不少于500個細胞,取均數并評分:不著色為0分,著色淡(淺黃色)為1分,著色深(黃褐色)為2分;著色細胞占計數細胞百分率: ≤5%為0分,6%～25%為 1分,26%～50%為2分,>51%為3分,染色程度與染色細胞百分率得分乘積為最后得分。0～1 分為陰性病例,2分以上為陽性病例。取材剩余組織低溫保存在標準固定液中。

1.4.2 RT-PCR檢測外周血caspase-3表達水平:使用外周血RNA試劑盒提取所有研究對象外周血總RNA,然后使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA,然后吸取5μL 含cDNA的樣品,加入10μL PCR預混料、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、4μL ddH2O,混勻后放入PCR擴增儀,以94 ℃ 5 min,然后94 ℃ 30 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,循環反應30個循環,72 ℃延伸10 min。將擴增產物取出后進行1%瓊脂糖凝膠電泳。在凝膠成像儀下觀察并拍照記錄,有條帶形成為陽性,無條帶形成為陰性。Caspase-3上游引物序列:5′-AGAGCTGCACTGCGGTATTGAG-3′,下游引物序列:5′-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3′;GAPDH內參上游引物序列:5′-ATCTTCCAGGAGCGAGAT-3′,下游引物序列:5′-TAAGCAGTTGGTGGTGCA-3′。DAB顯色,采用圖像分析測定儀量化caspase-3灰度積分比值,作為caspase-3蛋白相對表達量。

1.5 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件統計,計數資料以率表示,2組比較采用χ2檢驗,等級資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測caspase-3的表達情況 免疫組化結果顯示,TNM分期與caspase-3的表達呈反比,分期越高，caspase-3的陽性率越低,分化程度與caspase-3的表達呈正比,分化程度越高,caspase-3的陽性率越高。不同性別caspase-3的表達陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。60～70歲病人caspase-3的表達陽性率比71～80歲病人,但是2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。不同浸潤深度與caspase-3的表達陽性率呈反比,隨著浸潤深度的增加，caspase-3的陽性率下降,不同腫瘤部位caspase-3的陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 RT-PCR檢測外周血caspase-3的表達情況 RT-PCR與免疫組化結果相似,TNM分期與caspase-3的表達呈反比,分期越高，caspase-3的陽性率越低,分化程度與caspase-3的表達呈正比,分化程度越高,caspase-3的陽性率越高。不同性別caspase-3的表達陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。60～70歲病人caspase-3的表達陽性率高于71～80歲組病人,但差異無統計學意義(P>0.05)。不同浸潤深度與caspase-3的表達陽性率呈反比,隨著浸潤深度增加,caspase-3的表達陽性率下降,不同部位caspase-3的陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 病人不同臨床情況組織中caspase-3的表達比較

3 討論

老年CRC是我國常見的惡性腫瘤,嚴重威脅著人類健康。近年來其準確的診斷和有效的治療已成為醫生以及科研工作者關注的熱點問題之一[5]。基于相關位點的早期鑒別診斷方法的建立對于CRC的早期診斷、早期治療以及提高病人的生存率就顯得十分重要。

腫瘤的發生不僅與細胞過度增殖有關,而且與細胞凋亡密切相關。Caspsae-3 是半胱氨酸蛋白酶家族中的一員,為執行細胞凋亡的關鍵酶之一,大多細胞凋亡途徑都通過caspase-3 引發細胞凋亡[6-7]。有研究人員用S-P的方法檢測了15例正常直腸黏膜、39例結直腸腺瘤和62例CRC標本的caspase-3的表達,結果顯示,在正常結直腸黏膜、腺瘤和腺癌的caspase-3陽性表達率分別為80%(12/15),56.4%(22/39)、和45.16%(28/62),腺瘤和腺癌與正常結直腸黏膜比較,caspase-3的表達有明顯差異[8]。

表2 RT-PCR檢測病人外周血caspase-3的表達情況

郝建軍等[9]對直腸癌組織中caspase-3的表達情況進行檢測,結果顯示caspase3在腫瘤組織中的陽性率為55.3%,與正常組織的表達率(78.6%)差異有統計學意義(P<0.05)。潘益峰等[10]對CRC和息肉中Caspase通路上基因表達水平進行檢測,發現CASPASE基因在腫瘤的發生過程中相互作用,相互促進。王文娟等[11]對caspase-3在CRC中的表達進行檢測,發現CRC組、腺瘤組caspase-3陽性表達率低于正常組,提示caspase-3表達與腫瘤分期呈反比。但關于老年這一特殊群體的caspase-3的表達情況尚未見報道。

本研究中,RT-PCR檢測外周血caspase-3的表達情況與免疫組化結果基本一致,隨著病人腫瘤分期的增加、分化程度的升高和浸潤深度的增加,caspase-3的表達呈現下降趨勢,表明caspase-3的表達受到抑制。老年人群是直腸癌的高發人群,本研究針對老年病人進行caspase-3的表達檢測,了解其表達特點,為進一步確定caspase-3作為老年CRC早期標志物提供了依據。