人間充質干細胞成脂分化調控機制的研究

單志強 許西 郭文婕

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來源于發育早期中胚層干細胞，具有干細胞的特性，來源廣泛，是開展干細胞移植、工程技術的理想種子細胞[1-2]。人MSCs成脂分化技術有成為人體軟組織修復技術，但MSCs的分化受到多種因素的影響，有關于調控機制的研究較少[3]。本文嘗試就此進行探。

1 材料方法

1.1 實驗材料

從健康骨髓捐獻骨髓中獲得5～10 ml樣本，采用傳統的人淋巴細胞分離液密度梯度離心法獲得骨髓單個核細胞。

1.2 儀器與試劑

試劑：DNA提取試劑盒，PCR鑒定引物，DMEM/F-12完全培養液，平衡鹽溶液PBS，胎牛血清、MTT試劑盒、雙抗等。儀器主要包括酶標儀、水浴鍋、低溫高速離心機、倒置顯微鏡照相系統、PCR儀、超凈工作臺、CO2細胞培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、普通離心機、超低溫冰箱等。

1.3 方法

1.3.1 培養、鑒定 將獲得的骨髓單個和西北，采用原代培養法進行培養，導致顯微鏡評估原代BM-MSCc貼壁生長情況，結果顯示貼壁良好，呈放射狀克隆性生長。而獲進行穿戴培養、擴增，獲得第一代細胞計為P1，而后繼續培養，當細胞生長到80%～90%融合，繼續采用消化離心穿戴培養法培養，依次將第2-n代細胞記作P2、P3、P4……，Pn代細胞。將獲得的各代細胞，1 200 rpm/5 min，室溫下離心，棄上清，采用DMSO凍存液重懸細胞沉淀，調整濃度為2.4×106/ml，每個凍存管1.5 ml懸液分裝，4 ℃冰箱保存30 min，而后-20 ℃凍存1 h，轉移到-80℃冰箱放置過夜，次日液氮罐保存，在1個月內使用。使用前，進行復蘇，以供使用。使用前，進行BM-MScs表面分子標志檢測，采用藻紅蛋白（PE）標記小鼠抗人單克隆抗體CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、CD34、CD31，異硫氰酸熒光素標記小鼠抗人單克隆抗體GAPD標記，同時分別采用相應PE-小鼠抗人IgG1、FITC-小鼠抗人IgG1作為同型對照抗體。

1.3.2 成脂分化能力與基因表達鑒定 （1）誘導BM-MSCs向脂肪細胞分化：①消化、離心收集P4-P6代BM-MSCs，采用4×104孔接種細胞，培養24 h，代細胞貼壁，棄培養液；②每孔加入2 ml成脂誘導培養基繼續培養，每隔3日，換液1次，持續14日；③完畢后棄培養液，PBS緩沖液洗洛細胞2次，4%甲醛固定30 min，PBS緩沖液洗滌細胞3次；④每孔加入0.2%油紅O染色1～2 m，37℃染色孵育30 min，吸去染液，PBS緩沖液洗滌細胞3次；⑤導致顯微鏡檢查。

（2）成脂細胞特異性基因RT-PCR檢測：對照組、成脂分化實驗組各個時間點，采用75 cm2培養瓶培養，培養后獲得細胞層，加入500 μl蛋白質裂解液，冰上裂解，期間晃動培養瓶，保證裂解液覆蓋在每一個角落，裂解完后，細胞刮刀刮下破碎的細胞懸液，轉入1.5 ml EP管，13 200 rpm，4 ℃離心20 min，轉入上清到EP管，沸水浴5 min使蛋白變性，冷卻后離心，轉移到新的EP管，分出100 μl定量，其余-70℃保存，收集蛋白質。采用Real-Time PCR驗證質譜分析，以差異蛋白組學分析得到的脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為檢測對象，利用NCBI數據庫設計引物，設計這些蛋白質的基因R-t PCR反應引物。

2 結果

2.1 間充質干細胞培養、傳代情況

分離培養得到的間充質干細胞，倒置顯微鏡觀察顯示如下，接種后可間少量形態各異的細胞貼于培養瓶底部，梭型、多角形不規則散在分布，培養5～7日后，貼壁成克隆性生長，14～21日細胞密度達到80%～90%融合，細胞排列整齊，細胞形態逐漸均一，成長梭型。見圖1 A～D。

圖1 間充質細胞-原代細胞培養各個時間表現情況

2.2 表面標記免疫熒光檢測

表面標記免疫熒光檢測結果如下，P3、P9、P16代的間充質干細胞CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、GAPDH表達不存在顯著差異，在進行傳代培養后，維持比較穩定的免疫表型標志物表達譜。從上到下分別為CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、GAPDH免疫表現，從左邊到有分別為第P3、P9、P16代細胞，見圖2。

2.3 向脂肪細胞誘導分化后的油紅O染色鏡下表現

誘導前5天，細胞形態沒有明顯變化。誘導第7天，部分細胞形態發生改變，形態學觀察顯示，誘導后的細胞體積增大，少部分細胞胞質內開始出現小脂滴。誘導10天后，含脂滴的細胞數量明顯增加，隨著細胞誘導時間的進行，小的脂滴匯合形成大的脂滴。在高倍鏡下觀察發現，誘導14天后含有脂滴的細胞數量比例明顯增多。未加成脂誘導劑的對照組細胞形態始終沒有明顯變化，細胞內也沒有脂滴出現。分別取實驗組和對照組誘導后第5天、10天、14天的細胞進行油紅O染色，可見實驗組第7天開始細胞內出現脂滴并被染成紅色，而且脂滴數量隨著誘導天數的增加而增加并由小的脂滴逐漸聚集成大的脂滴。而對照組細胞油紅O染色均呈陰性。

圖2 表面標記免疫熒光檢測結果

2.4 脂肪細胞特異性基因檢測

脂肪細胞特異性基因RT-PCT檢測結果如下，相較于對照組，實驗組第7天、10天、14天的LPL、PPAR-γ基因表達高于對照組（無表達），同時隨著時間的延長，表達信號強度明顯逐漸上升，提示間充質干細胞成脂化與LPL、PPAR-γ基因表達有關，見圖3。

圖3 脂肪細胞特異性基因RT-PCR檢測

3 討論

LDL即脂蛋白脂肪酶基因，其中內含子6中PVU Ⅱ多態位點和內含子8中HindⅢ多態位點與高脂血癥有關，并為高脂血癥的家系連鎖分析提供了遺傳標記，增加CM殘粒結合到LPL受體的能力[4-5]。本次研究顯示，人間充質干細胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達增強有關，特別是在第7日達到脂分化高峰，在第10日仍然呈現持續脂分化。提示PPARs控制許多細胞內的代謝過程，是重要的細胞分化轉錄因子，在哺乳動物脂肪組織中呈現高表達[6-7]。在敲除PPAR-γ基因試驗中，小鼠往往會在胚胎期死亡，體現PPAR-γ基因的重要性[8]。PPAR-γ基因與脂代謝過程中的多種基因如脂肪酸吸收（LPL）、脂類運輸（Fabp4）等關系密切，通過調節脂肪因子表達，從而參與成脂化[9]。

需要注意的是，本文中采用誘導劑誘導成脂化，而充間質干細胞的分化影響因素較多，其他成脂分化的具體機制有待進一步研究[10]。除以上特異性基因外，還存在其他許多脂肪因子基因，有鑒于成脂化的復雜機制，需要開展更多的基因分析，以構建基因表達網絡，為成脂化調控提供理論基礎[11-12]。由此可見，人間充質干細胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達增強有關。

綜上所述，人間充質干細胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達增強有關。