內毒素休克誘導急性腎損傷家兔模型的建立

邵 俊, 方時書, 鄭瑞強, 陳齊紅, 林 華, 於江泉, 薛 露

(1. 江蘇省蘇北人民醫院&揚州大學臨床醫學院 重癥醫學科, 江蘇 揚州, 225001;2. 江蘇省泰州市人民醫院 重癥醫學科, 江蘇 泰州, 225300)

感染性休克所致急性腎損傷(AKI)具有高發病率、高死亡率[1]。鑒于臨床上很難做到對可疑或確診AKI患者進行及時的、多次的腎臟病理學監測，因而成功建立感染性休克所致AKI動物模型就顯得尤為重要[2-3]。本研究探討內毒素誘導感染性休克家兔模型的建立以及是否存在AKI, 現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級雄性新西蘭大白兔12只，購自南京安立默實驗動物中心[動物合格證號SCXK(蘇)2010-0002], 體質量(2.60±0.29) kg。按隨機數字表法將12只新西蘭大白兔分為對照組(C組)和模型組(S組)，每組6只。

1.2 主要實驗試劑

大腸桿菌內毒素(LPS, E. coli血清型O55: B5)購自美國Sigma公司，兔Cr-ELISA試劑盒購自上海裕平生物有限公司。

1.3 內毒素休克家兔模型建立

S組家兔實驗前禁食12 h、禁水4 h, 檢測體質量后行左耳緣靜脈留置穿刺，以20%烏拉坦5 mL/kg靜脈注射誘導麻醉，麻醉期間予面罩吸氧(流量3 L/min), 實驗過程中采用咪達唑侖0.05 mg/(kg·h)、丙泊酚0.5 mg/(kg·h)持續鎮靜以維持麻醉，麻醉深度以無自主運動、角膜反射消失為目標，需要時緩慢注射20%烏拉坦1 mL追加麻醉。取甲狀軟骨下第3、4軟骨間隙先橫向切開，再縱行向上切開第2、3軟骨環(即倒T切開氣管)，置入3.5號氣管插管3～4 cm, 接呼吸機輔助通氣。機械通氣: 呼吸機參數設定為容量控制模式(VCV), 潮氣量(VT)為10 mL/kg, 頻率(f)為40次/min, 呼氣末正壓(PEEP)為0～2 mmHg, 吸入氧濃度(FiO2)為40%～80%, 實驗過程中依據血氣分析結果調整VT和FiO2使目標血氣達到動脈血氧分壓 [p(O2)]在80 mmHg以上，動脈血二氧化碳分壓[p(CO2)]在30～50 mmHg。頸外靜脈穿刺置管，置入4 F雙腔中心靜脈導管5～6 cm, 再經右股動脈置入3F PiCCO動脈導管，再接 PiCCO監護儀(Picco-PLUS德國PULSION公司)進行血流動力學監測。以5 F導尿管行導尿術，記錄每小時尿量。經耳緣靜脈持續緩慢勻速泵LPS, 總量為2 mg/kg, 為使注射液體量一致，注射液體量為2.5 mL/kg, 注射速度嚴格控制在約0.2 mL/min, 保證LPS輸注時間為30 min左右。注射LPS后，觀察平均動脈壓(MAP)下降至基礎的40%即認為造模成功[4]。C組家兔經耳緣靜脈勻速泵入等量生理鹽水。本實驗動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.4 指標觀測及標本留取

選擇造模前基礎狀態(Tx)、感染性休克成模時(T0)、成模后3 h(T3)、成模后6 h(T6)為觀察時間點。經中心靜脈導管監測中心靜脈壓(CVP), 經PiCCO監護儀監測MAP、心率(HR)、心臟指數(CI)、體循環阻力指數(SVRI)、全心舒張末期容積指數(GEDVI)、心室收縮力指數(dpmax)、每搏輸出量變異率(SVV)、血管外肺水指數(EVLWI)。記錄各時間點的尿量、血肌酐(SCr)、動脈血乳酸(Lac)、動脈血pH值。觀察6 h后處死動物，留取腎臟組織標本行HE染色和透射電鏡顯微鏡觀察腎組織結構改變。

1.5 急性腎損傷兔成模的標準

以兔感染性休克成模后6 h腎小管組織病理學病變為成模標準，成模應符合下述3項表現之一: ① 腎小管出現水腫、管腔變小; ② 上皮細胞空泡樣改變，細胞界限不清; ③ 出現腎小管明顯壞死。

1.6 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件包進行分析處理。計量資料采用單因素方差分析，方差不齊時則采用非參數檢驗法; 二元變量的相關分析采用Pearson相關系數，若為非正態分布資料則采用Spearman相關系數。實驗數據用均數±標準差表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血流動力學及代謝指標比較

與C組相比, S組Tx時MAP、HR、CVP、CI、SVRI、GEDVI、dpmax、SVV、EVLWI、pH、Lac無顯著差異(P>0.05), T0時MAP、SVRI、GEDVI、dpmax、pH均顯著下降(P<0.01), SVV、Lac顯著升高(P<0.01), 而HR、CVP、CI、EVLWI均無顯著變化(P>0.05); S組T3及T6時MAP、CI、SVRI、GEDVI、dpmax、pH值均較C組顯著下降(P<0.01), HR、SVV、Lac顯著升高(P<0.01), CVP、EVLWI均無顯著變化(P>0.05)。S組組內與Tχ比較, T0、T3、T6時MAP、CI、SVRI、GEDVI、dpmax、pH較Tχ顯著下降(P<0.05), HR、Lac顯著升高(P<0.01), 而CVP、EVLWI均無顯著差異(P>0.05), SVV在T0時較Tx時升高，但差異無統計學意義(P>0.05), T3、T6時顯著升高(P<0.01)。C組上述指標在組內各時間點比較均無顯著變化(P>0.05)。見表1-3。

2.2 腎功能指標

S組6 h總尿量為(27.00±7.62) mL, 顯著少于C組的(81.33±6.74) mL (P<0.01)。S組SCr在注射內毒素后呈現上升趨勢，從Tx時的(16.10±0.76) μmol/L升至T6時的(31.56±1.53) μmol/L, 組內各時間點差異均有統計學意義(P<0.05), 且T0后各時間點與C組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 C組和S組不同時間點血流動力學指標比較

與C組比較, *P<0.05, **P<0.01。

表2 C組和S組不同時間點血流動力學指標比較

與C組比較, **P<0.01。

2.3 腎組織HE染色和透射電鏡下結構改變

HE染色鏡下見C組腎小球、腎小管結構完整，染色均勻，細胞形態完整清晰; S組6只家兔腎小球結構完整，腎間質有炎細胞浸潤，腎小管出現水腫、管腔變小，上皮細胞空泡樣改變，細胞界限不清，但未見有明顯壞死表現。

表3 C組和S組不同時間點血流動力學指標比較

與C組比較, **P<0.01。

C組腎臟超微組織病理學改變: 腎組織超微結構正常，內皮窗孔清晰，內皮與基底膜連接緊密，基底膜無增厚、無腫脹，厚薄均勻，足突清晰、排列整齊、均勻，呈柵欄狀; 近曲小管上皮細胞核仁明顯，線粒體豐富少量溶酶體顆粒沉積，微絨毛豐富，排列致密有序，細胞基底部與基底膜連接緊密。

S組腎臟超微組織病理學改變: 腎小球細血管結構完整，毛細血管內皮細胞腫脹，部分線粒體水腫、胞質空泡化，內皮細胞間隙縮小，基底膜完整連續，足突細胞腫脹，系膜間質可見炎性細胞浸潤; 腎小管上皮細胞腔面微絨毛部分缺失、脫落、紊亂，細胞內溶酶體及吞噬細胞泡增多，胞質部分空泡變性。腎小管上皮細胞可見皺縮、染色質濃縮、核裂解，可見部分凋亡小體。按組織病理學成模標準，實驗組6只家兔均造模成功。

3 討 論

Langenberg C等[5]系統回顧近40年來有關感染性休克所致AKI的組織病理學研究，其中僅有20篇可以用作統計分析，其中14篇是來自于動物模型，且一半以上是用LPS誘導的AKI模型，成模標準并非一致，選擇的動物亦不相同。本研究采用LPS誘導造模，并以腎小管組織病理學變化來確認內毒素休克所致AKI的家兔模型的建立。

本研究中模型組動物在接受內毒素后均出現了MAP的下降，下降幅度均較基礎值超過40%, 且同時表現出CI下降、SVRI下降、HR增快、GEDVI的下降，是明顯的低排低阻的血流動力學狀態。內毒素性休克的主要病理生理改變包括有效循環血容量的不足、組織灌注不足、細胞核組織器官功能的損害，其血流動力學狀態為“高排低阻”[6-8]。楊毅等[9]研究提示如未進行有效液體復蘇，感染性休克的血流動力學特點為“低排高阻”狀態。本研究結果提示，在T0時表現為心輸出量和外周阻力均下降狀態，但在Tx至T0造模的時間段內觀察到PiCCO提示外周阻力是有上升的，但此段時間為觀察造模階段, MAP并未達到預設目標, SVRI維持上升一段時間后出現持續下降。陳秀凱[10]研究提示，在2 min內給予新西蘭大白兔勻速緩慢注射2 mg/kg的LPS可以誘導內毒素休克模型，其模型成功時間在60 min內。本研究為更好地模擬內毒素的持續釋放入血效應，給予30 min的注射時間，觀察結果提示成模時間在60～90 min, 這也許正是本研究的實驗結果出現成模時間晚，但心肌抑制和外周血管舒張更嚴重的原因，即在T0時表現出“低排低阻”現象。

2012年最新的改善全球腎臟病預后組織(KDIGO)指南推薦仍采用SCr作為診斷AKI的重要指標[11-14]。本研究中SCr在LPS致內毒素休克后持續升高，模型組Tx時SCr為(16.09±0.76) μmol/L, T6時為(31.56±1.53) μmol/L, T6時SCr為Tx時的1.96倍; 且模型組觀察時間窗內總尿量僅為對照組的1/3左右，尿量明顯減少。按照KDIGO指南標準，家兔在LPS誘導后至觀察時間終點T6時已出現內毒素休克所致AKI。

雖然目前對感染性休克所致AKI的組織病理學研究較少，且存在爭議，但是多數學者[15-18]贊同腎小管細胞受損是其病理組織學基本特征的觀點。Langenberg C等[5]研究提示在已有的感染性休克所致AKI的患者組織病理學資料中，急性腎小管壞死(ATN)的出現率不足25%, 而在靈長類動物感染性休克所致AKI的模型中ATN的出現率也僅為37%左右，在大鼠感染性休克所致AKI的模型中ATN只在23%的樣本中可觀察到。可見只有少數的組織病理發現有典型的ATN的表現，大多數形態正常或僅出現輕微非特異性的改變[19]。本研究中，兔腎臟組織在光學顯微鏡下可觀察到腎小球結構完整，腎間質炎性細胞浸潤，腎小管出現水腫、管腔變小，部分刷狀緣消失、上皮細胞空泡樣改變，細胞界限不清，但未見有明顯ATN表現，這一觀察結果與CaiTaway等[20]在膿毒癥狒狒的腎臟病理切片中觀察到的特點相似，與李錦艷等[21]研究LPS致大鼠AKI后觀察到的腎臟病理學結果一致。此外，經透射電鏡觀察到的腎臟近端小管上皮細胞的損傷性變化，進一步證實了LPS可誘導出內毒素休克性AKI。

感染休克所致AKI的組織病理學特點除了腎小管上皮細胞損傷外，細胞凋亡也是其主要表現形式[22-23]。張彧等[24]研究提示，膿毒癥早期腎組織細胞凋亡數量增加，與細胞因子等大量釋放有關。Jo SK等[25]研究提示，腎小管上皮細胞凋亡可能是內毒素血癥時腎損傷的潛在機制。Li Wan等[19]在綿羊膿毒癥休克模型制作中進一步證實了這一機制的可能: 腎小管上皮細胞中的致凋亡蛋白BAX升高，而抑制凋亡的蛋白Bcl-xL下降，提示在膿毒癥早期的腎臟中細胞凋亡機制即可被激活。本研究中透射電鏡觀察腎臟組織時發現腎小管上皮細胞有皺縮、染色質濃縮、核裂解現象，甚至可見凋亡小體。這一結果進一步證實了本研究成功復制出內毒素休克性AKI的家兔模型。