蒺藜苜蓿MtLEA5B的克隆和功能分析

張業(yè)猛 沈迎芳 王英芳 姚品雅 王海慶

（1. 中國科學院大學西北高原生物研究所 高原適應與進化重點實驗室，西寧 810002；2. 中國科學院大學，北京100049）

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白在種子發(fā)育后期階段不斷積累而得名［1］。LEA蛋白分布極為廣泛，植物的其他組織和器官經(jīng)非生物脅迫和ABA能誘導LEA蛋白的合成［2，3］，此外在蛭形輪蟲、細菌、昆蟲、線蟲中都有發(fā)現(xiàn)LEA蛋白的存在［4-6］。LEA蛋白不僅能提升生命體對逆境脅迫的耐受性［7-9］，而且LEA蛋白的異源表達也能提升轉(zhuǎn)化子對逆境脅迫的耐受性。Wang等［10］將小麥TaLEA3導入羊草（Leymus chinensis plants）后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因羊草對干旱的耐受性明顯提升。所以，LEA蛋白不僅是非生物脅迫環(huán)境因素選擇的靶位點，也是局部研究植物適應機制的目標基因之一，克隆LEA明確其作用機制，對于轉(zhuǎn)基因技術改良植物的抗逆性具有重要意義。

LEA蛋白根據(jù)不同的分類方法有不同的命名［11-13］，Battaglia等［14］根據(jù)氨基酸同源性和保守基序?qū)EA蛋白分為7組。LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_6和LEA_7組都有特定的保守基序，被視為典型LEA蛋白；而LEA_5組因為沒有明顯的保守基序或相似序列，被認為是非典型LEA蛋白。不同的LEA蛋白家族在功能和作用機制上并不具有明顯的相似性，小麥中Em蛋白（LEA_1）體外可以防止檸檬酸合成酶的凝聚和失活［15］；擬南芥中AtEm6（LEA_1）蛋白不僅是種子發(fā)育所必需，也能響應高鹽脅迫［16-17］。LEA_2蛋白內(nèi)在的無序結構，主要作為分子伴侶來發(fā)揮冷凍保護［18］。LEA_3可以響應多種脅迫，例如，水稻中OSLEA3（LEA_3）可以響應ABA誘導和高鹽脅迫［19］，玉米中的ZmLEA3（LEA_3）可以響應于高鹽、低溫、ABA誘導等多種途徑［20-21］。LEA_5B家族的SAG21可以提升擬南芥對細菌病原體的耐受性和抗氧化能力，LEA_5A家族的Rab8可以提升玉米對干旱的耐受性［22］。

目前，LEA_5蛋白作為一類非同源蛋白，其功能機制尚且十分模糊。本研究從蒺藜苜蓿A17幼苗中克隆到一個編碼胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因MtLEA5B。并通過生物信息學方法對其進行分析，運用RT-PCR和原核表達對其表達模式和對宿主菌在溫度脅迫條件下的保護進行驗證，為轉(zhuǎn)基因技術改良植物的抗逆性提供參考奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

將蒺藜苜蓿A17種子用濃硫酸處理5-10 min，用雙蒸水洗滌多次除去殘余硫酸。處理后的種子置于含有1/2 MS固體培養(yǎng)基中，4℃春化2 d移至21℃、16 h/8 h光照條件下萌發(fā)。3 d后將已發(fā)芽的幼苗移栽到蛭石∶營養(yǎng)土（3∶1）的混合基質(zhì)中，在21℃、16 h/8 h光照條件下生長，每7 d用復合肥溶液澆灌1次。 所用引物的合成由上海生物生工合成（上海）。

表1 試驗所用引物

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理 將生長3周的幼苗進行非生物脅迫和ABA處理。NaCl脅迫處理：用150 mmol/L NaCl水溶液澆灌培養(yǎng)基質(zhì)，分別于0和8 h及1和3 d取樣；ABA脅迫處理：將整株幼苗取出洗凈砂石后，轉(zhuǎn)移至鋪有多層吸水紙的培養(yǎng)皿中，用0.05%Tween 20（V/V）的100 μmol/L脫落酸溶液噴灑，封蓋防止植物脫水，分別于0、1、3和6 h取樣；脫水脅迫處理：將幼苗取出洗凈砂石，溫室自然脫水，分別于0、4、8和12 h取樣；低溫脅迫處理：將幼苗轉(zhuǎn)移至4℃、16 h/8 h光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分別于0和8 h及1和3 d，取樣。取樣后迅速液氮冷凍，-80℃冰箱保存，每組處理設3次生物學重復。

1.2.2 MtLEA5B的克隆和序列分析 脅迫處理樣本總RNA提取使用TRIzol?試劑（Invitrogen，USA），參照說明書使用Recombinant DNase I（RNase-free，TaKaRa，大連）去除基因組DNA。cDNA第一條 鏈 按 PrimeScript ?RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa，大連）的操作說明合成。以蒺藜苜蓿轉(zhuǎn)錄組cDNA為模板，MtLEA5BF/R為引物，用PyrobestTMDNA聚合酶（TaKaRa，大連）進行30次PCR擴增。使用PCR純化試劑盒（上海生工生物，上海）純化回收。

采用DNAMAN軟件分析核酸序列；用ExPASy網(wǎng)站（http://web.expasy.org/translate/）分析開放閱讀框OPF；用NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行核苷酸和蛋白質(zhì)相似性檢索；用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和Pfam（http://pfam.xfam.org/）進行蛋白質(zhì)序列分析［23］。

1.2.3 MtLEA5B原核表達載體構建 將上述PCR純化產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和SacⅠ雙酶切連接到pET30a載體中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株（DH5α），篩選陽性克隆提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定，獲得原核表達載體pET30a-MtLEA5B。

1.2.4 MtLEA5B蛋白的異源表達和熱穩(wěn)定性分析 將質(zhì)粒pET30a和pET30a-MtLEA5B轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）菌株內(nèi)。在含有50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)皿中篩選陽性克隆，接種于10 mL含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)。12 h后，按照1∶100（V∶V）轉(zhuǎn)接到5 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)OD600=0.6-0.8。菌液中加入異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至最終濃度1.0 mmol/L。誘導3 h，取1 mL pET30a和pET30a-MtLEA5B菌液作為第一組，另取1 mL pET30a和pET30a-MtLEA5B菌液作為第二組。

將2組誘導樣品8000 r/min離心2 min，棄上清，用80 mL的滅菌雙蒸水重懸，第一組直接100℃金屬浴10 min；第二組加入20 μL 5×SDS，100℃金屬浴10 min。15000 r/min離心5 min，取上清，第1組加入20 μL 5×SDS。各取6 μL進行SDS-PAGE進行電泳。

1.2.5 異源表達大腸桿菌轉(zhuǎn)化子抗逆性試驗

1.2.5.1 定性試驗 將含有pET30a-MtLEA5B和pET30a載體的大腸桿菌進行液體培養(yǎng)和誘導，培養(yǎng)和誘導條件如1.2.4所述。培養(yǎng)誘導后的菌液OD600=0.9，用含有50 mg/L卡那霉素和1.0 mmol/L IPTG的LB液體培養(yǎng)基將誘導菌液分別稀釋10、100和1000倍，取原誘導菌液和稀釋菌液進行脅迫處理試驗。溫度脅迫試驗中分別用60℃金屬浴溫育30 min和-20℃冰箱冷凍24 h。將上述脅迫菌液和對照組菌液取10 μL滴加到含有1.0 mmol/L IPTG和50 mg/L卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基中。37℃倒置培養(yǎng)24 h后進行觀察。

1.2.5.2 定量分析 大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)、IPTG誘導、脅迫條件以及LB固體培養(yǎng)基與1.2.5.1相同，當IPTG誘導菌液培養(yǎng)OD600=0.9，用含有50 mg/L卡那霉素和1.0 mmol/L IPTG的LB液體培養(yǎng)基稀釋10倍，取100 μL均勻涂于固體LB培養(yǎng)基中，37℃倒置培養(yǎng)24 h進行菌落計數(shù)，公式如下：

2 結果

2.1 MtLEA5B的克隆和序列分析

以蒺藜苜蓿幼苗樣品cDNA為模板進行擴增，獲得MtLEA5B的cDNA序列，長度為285 bp；編碼94個氨基酸（圖1-A），預測分子量為10.05 kD，理論 等 電 點（pI） 為 9.40（https://web.expasy.org/cgibin/protparam/protparam）。基因序列在JCVI數(shù)據(jù)庫（http://www.jcvi.org/）中顯示MtLEA5B是位于第1染色體編碼胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因；MtLEA5B蛋白富含丙氨酸（12.72%）和纈氨酸（11.70%），而半胱氨酸和組氨酸含量為0；DNAMAN軟件顯示平均親水系數(shù)為-0.472（圖1-B）。

圖1 蒺藜苜蓿MtLEA5B的序列分析

通過進行BlastP分析，MtLEA5B蛋白包含Pfam LEA_3結構域，并且與地三葉（Trifolium subterraneum）、大豆（Glycine max）、木豆（Cajanus cajan）和菜豆（Phaseolus vulgaris）豆科植物的LEA蛋白具有較高的相似性（圖2）。

2.2 MtLEA5B在非生物脅迫條件下表達特性分析

通過對不同脅迫下MtLEA5B的半定量RT-PCR分析（圖3），發(fā)現(xiàn)MtLEA5B表達量上調(diào)，在蒺藜苜蓿幼苗中為誘導型表達。

圖2 蒺藜苜蓿MtLEA5B與其他植物LEA蛋白氨基酸序列比對分析

圖3 ABA誘導和非生物脅迫條件下MtLEA5B的RTPCR分析

2.3 pET30a-MtLEA5B載體的構建和MtLEA5B蛋白表達特性的分析

重組質(zhì)粒pET30a-MtLEA5B經(jīng)酶切鑒定（圖4-A），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株BL21（DE3），進行SDS-PAGE電泳檢測。結果（圖4-B）顯示，MtLEA5B蛋白原核表達理論值是10.05 kD，但是發(fā)現(xiàn)表達重組蛋白相比于蛋白理論分子量略大，并且誘導菌液直接在無菌水中煮沸，大部分蛋白都已變性，但目的蛋白含量未發(fā)生太大變化，表明MtLEA5B蛋白的高度偏向性導致其具有較高的抗性，在SDS變性溶劑和高溫煮沸條件下仍然存在部分結構。

圖4 pET30a-LEA5B表達載體酶切鑒定（A）和SDSPAGE電泳檢測（B）

2.4 MtLEA5B異源過表達對大腸桿菌的脅迫保護

為鑒定大腸桿菌中過表達MtLEA5B是否對宿主菌具有保護作用。將含有pET30a-MtLEA5B和pET30a載體的大腸桿菌BL21（DE3）分別培養(yǎng)至OD600=0.9，經(jīng)60℃高溫和-20℃冷凍脅迫處理，發(fā)現(xiàn)含有pET30a-MtLEA5B載體的大腸桿菌生存狀態(tài)明顯增多（圖5-A）。

菌落計數(shù)結果（圖5-B）顯示，在60℃高溫脅迫處理后，含有BLpET30a載體的菌株菌落形成率僅有4.29%，含有pET30a-MtLEA5B載體的菌株菌落形成率為13.88%；在-20℃冷凍脅迫處理后，含有pET30a載體的菌株菌落形成率僅有9.39%，含有pET30a-MtLEA5B載體的菌株菌落形成率為18.16%。

圖5 LEA5B蛋白過表達對大腸桿菌溫度脅迫的保護

3 討論

LEA蛋白與植物逆境脅迫耐受性密切相關，可以維持植物在極端環(huán)境條件下的正常生命代謝活動［24-27］。本研究在蒺藜苜蓿幼苗中克隆到定位于第1染色體上的MtLEA5B，編碼LEA_5B類蛋白，經(jīng)疏水氨基酸殘基預測MtLEA5B蛋白具有較高的親水性。MtLEA5B蛋白的氨基酸序列與地三葉、大豆、木豆等豆科植物具有高度一致性，表明LEA_5B蛋白具有種屬特異性。其表達模式響應于高鹽、脫水、溫度脅迫和ABA處理，但MtLEA5B在不同脅迫條件下響應不盡相同，表明MtLEA5B參與蒺藜苜蓿對非生物脅迫抗性反應過程是復雜的，可能通過多種信號通路交叉進行。

雖然有實驗結果對特定LEA蛋白功能和機制進行闡述，但LEA_5蛋白是一類疏水殘基高于典型LEA蛋白的非同源蛋白，這些結果并不具有普適性。Baker和Galau等［28-29］發(fā)現(xiàn)LEA_5蛋白沸水孵化可能形成一種不溶的球形構象。本研究中，經(jīng)沸水孵化后，大部分大腸桿菌細胞的內(nèi)生蛋白質(zhì)消失在上層清液與總蛋白提取的SDS樣品緩沖中，但是MtLEA5B重組蛋白數(shù)量上并沒有造成明顯減少，推測原因是MtLEA5B重組蛋白質(zhì)中富含的極性丙氨酸殘基使具有較高熱穩(wěn)定性和親水性，以及較短的氨基酸序列賦予它靈活的結構。此外，重組MtLEA5B蛋白的表觀分子質(zhì)量明顯高于估計的分子質(zhì)量，其原因可能是LEA蛋白分子的高親水性或無序結構導致其在沸水和SDS中仍存在部分結構。

眾多研究表明，異源表達LEA蛋白能夠提升植物和細菌對非生物脅迫的耐受性［30-34，］。Rodriguez-Salazar等［35］研究發(fā)現(xiàn)LEA1蛋白響應于囊腫干燥且能提升維氏固氮菌高溫耐受性。Wu等［36］發(fā)現(xiàn)過表達SmLEA可以增強大腸桿菌和丹參對干旱和高鹽脅迫的耐受性。本研究在大腸桿菌中過表達MtLEA5B蛋白，明顯增強了大腸桿菌對溫度脅迫的耐受性。但是，MtLEA5B蛋白過表達在高鹽和脫水條件下未發(fā)現(xiàn)有明顯的保護作用，推測MtLEA5B對不同的脅迫有不同的響應機制［37-38］。此外有研究表明，LEA蛋白對植物的發(fā)育過程也具有調(diào)控作用［39-40］。因此MtLEA5B是否存在其他的調(diào)控機制尚且不明，需要進一步科研進行證實。

4 結論

從蒺藜苜蓿中克隆獲得MtLEA5B，其受外源激素ABA和高鹽、脫水和溫度脅迫的調(diào)控；其編碼的蛋白質(zhì)屬于LEA_5B蛋白家族，在SDS變性劑和高溫煮沸條件下仍能保持一定的結構。MtLEA5B在大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中超表達可以增強大腸桿菌對溫度脅迫的耐受性。