鹽芥EsABCG25的克隆及其表達分析

松布爾巴圖 陳悅 陳寧美 唐帥 徐小靜

（中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081）

ABC轉運蛋白，即腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporters），是目前已知最大、最古老的蛋白家族之一，廣泛存在于植物細胞的質膜、液泡、線粒體和過氧化物酶體中，在植物生理活動中發揮各自作用［1-2］。植物中ABC轉運蛋白種類繁多、結構復雜、功能多樣。它們參與植物體內激素、脂質、金屬離子、次生代謝物和外源物質的運輸，且與植物抵抗病原體和逆境脅迫響應有關。

ABC轉運蛋白的主要特征就是含有一個ATP結合盒的結構［3］，成員通常含有1-2個核苷酸結合結構域（Nucleotide-binding domains，NBDs）和1-2個跨膜結構域（Transmembrane domains，TMDs）。TMD通常含有4-6個跨膜的α螺旋，NBD結構域則是一個長度約200個氨基酸的保守區域［4］。ABC蛋白通過NBD的結構特征和成員間的多基因親緣關系來分類［5-6］。ABCG蛋白是植物中最大的ABC蛋白亞家族［7］。擬南芥全基因組測序結果顯示其包含131個ABC轉運蛋白基因，其中ABCG是數量最多的亞族（44個）［8］。ABCG亞家族分為兩類。一類是WBC（White-brown complex）型，稱為半分子轉運蛋白。另一類為PDR（Pleiotropic drug resistance）型，稱為全分子轉運蛋白［9］。目前，對植物ABCG蛋白的分布和功能開展了廣泛研究。如擬南芥AtABCG11能運輸角質和蠟質單體，對表皮形成有極重要的作用［10-12］；小立碗蘚中PpABCG7突變會使表皮蠟質積累出現缺陷，降低小立碗蘚對干旱脅迫的抵抗能力［13］；水稻ABCG15對于花藥分裂和花粉發育是必需的［14］；百脈根 LjABCG1參與植株抗病性［15］；苜蓿MtABCG10可能參與植物抗毒素合成相關的類黃酮水平調節［16］。ABCG家族成員在植物激素信號轉導相關途徑中也發揮了作用［17-18］。2010年，Kuromori等［19］發現AtABCG25是植物激素脫落酸（ABA）的轉運蛋白，它以同源二聚體的形式，參與細胞間ABA信號通路，對葉表面的氣孔產生調節作用。過表達該基因后，保衛細胞表現出更強的ABA信號以及水分的高效利用，從而增加擬南芥的抗旱性［20］。此外，部分植物的ABCG25的cDNA序列及其演繹的氨基酸序列已經登錄至GenBank，為研究其功能提供了基礎。

鹽芥（E. salsugineum）是十字花科鹽芥屬植物。作為模式植物擬南芥的近緣物種，鹽芥具備生活周期短、自花授粉、基因組小、易誘變轉化等和擬南芥相似的特征［21］。研究表明，鹽芥具有對包括干旱、高鹽、異常溫度等多種逆境的更強的耐受性［22-26］。鹽芥全基因組序列的解析，為進一步從分子遺傳水平探究鹽芥抗逆性奠定了基礎［27］。這使鹽芥在逆境響應與耐受的分子機制研究方面更具價值。但目前對于鹽芥ABCG家族成員及其基因的結構、分布和功能還所知甚少。為了探索鹽芥ABCG25的結構特征及其在鹽芥抗逆性機制中的作用，本研究以已報道的鹽芥EST數據庫中的序列為模板設計引物，通過電子克隆技術獲得EsABCG25的cDNA全長序列，并通過生物信息學方法對其進行分析，同時對EsABCG25的組織特異性和脅迫響應表達進行探究，旨在為進一步闡明EsABCG25的功能及其與鹽芥逆境響應機制之間的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽芥材料生態型為山東型，其種子為實驗室保存。克隆載體為pGEM-T easy（Promeaga公司）。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。采用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取鹽芥組織總RNA。逆轉錄酶M-MLV、T4 DNA連接酶和DNaseI等試劑均購自Promeaga公司。質粒提取和凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，SYBR Premix Ex TaqTM試劑購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 鹽芥材料的準備 鹽芥種子依次用75%乙醇消毒1 min和1%次氯酸鈉消毒10 min，用滅菌水沖洗5次，每次2 min。之后將種子均勻鋪于MS平板中，于4℃黑暗條件下春化一周。春化結束后置于光暗周期16 h/8 h，光照強度100 μE/m2/s，溫度22℃的環境條件下培養。2周后將幼苗移栽入蛭石中繼續培養，期間用營養液澆灌。培養4周后，取長勢相近的植株，分別進行脅迫處理。NaCl處理：用含有200 mmol/L NaCl的營養液澆灌。干旱處理：停止澆灌營養液至蛭石基質完全失水。低溫處理：將鹽芥植株置于培養箱中4℃培養，正常澆灌營養液。ABA處理：葉面噴灑50 μmol/L的ABA溶液。在NaCl、低溫和ABA處理12 h、24 h、1周時取中等大小葉片；干旱脅迫1-2周待葉片出現明顯萎蔫后復水12 h，取鹽芥葉片。采集的葉片經液氮速凍后，-80℃保存備用。上述取材時均以未處理的鹽芥葉片作為對照。此外，正常條件下生長的鹽芥植株，待其開花結果之后，分別取根、蓮座葉、莖生葉、莖、花和角果等組織，液氮冷凍后，-80℃保存備用。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 用Trizol試劑提取鹽芥各組織的總RNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，通過檢測后，以Oligo dT（16）為引物進行逆轉錄。逆轉錄體系為25 μL，包括DEPC-ddH2O 13 μL、Rasin 1 μL、RNA 模 板 2 μL 和 Oligo dT（16）（10 μmol/L）1 μL。混勻后，70℃預變性 10 min，置于冰上冷卻。之后依次加入5×MLV buffer 5 μL、dNTP（10 mmol/L）2 μL 和 M-MLV 1 μL，混勻后42℃反應9 min合成cDNA。完畢后，80℃變性5 min，-20℃保存備用。

1.2.3 EsABCG25的電子克隆 以擬南芥AtABCG25序列（At1G71960）為參照對鹽芥的ESTs進行Blastn比對。利用在線序列拼接程序CAP3對搜索到的與AtABCG25相似性較高的鹽芥EST序列進行拼接。獲得序列重疊群后，再以之為種子重復上一步直至序列不能延伸為止。根據最終獲得的核酸序列設計上游和下游引物（EsABCG25P1：5'-CTCTCGTTCATTCTCTCAG-3'和EsABCG25P2：5'-GCTTAAATATTCCGAATTAA-3'）。 以 cDNA 為 模板進行PCR擴增。PCR體系為25 μL，包含1×Taq酶buffer、0.25 mmol/L dNTP、上游和下游引物（0.4 μmol/L）、PfuDNA聚合酶1 μL以及cDNA模板。首先加入除DNA聚合酶外的其他組分，混勻后94℃預變性3 min，加入聚合酶進行PCR循環反應，反應程序為94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個循環，72℃ 10 min。PCR產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后與pGEM-T easy克隆載體連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α。通過藍白斑篩選鑒定陽性克隆，送樣至上海生物工程有限公司測序。

1.2.4 EsABCG25及其編碼蛋白的生物信息學分析 EsABCG25的染色體定位通過使用Bioedit軟件進行該基因序列與鹽芥7條染色體DNA序列的BLASTN的結果來確定，位置圖使用MapInspect軟 件（http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software_mapinspect.html）繪制。使用Gene Structure Display Serve 2.0［28］（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）對基因內含子與外顯子結構進行分析。使用DNAMAN5.0軟件對EsABCG25編碼氨基酸序列進行演繹并分析其氨基酸組成。利用ProtScale工具（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質的分子量、疏水性、極性變化以及預測等電點［29］。蛋白質二級結構預測分別通過SOPMA服務器（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SMART在線數據庫（http://smart.embl-heidelberg.de/）進行［30-31］。對于該基因的系統進化分析，首先通過NCBI Protein Blast工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索EsABCG25編碼氨基酸序列的同源序列，再將獲得的同源序列及EsABCG25氨基酸序列通過GeneDoc軟件進行多序列比對，用MEGA5.2軟件根據多序列比對結果構建系統進化樹。

1.2.5 高通量測序分析EsABCG25的組織特異性表達與可變剪接事件 利用實驗室的鹽芥六種組織的高通量轉錄組測序文庫（由深圳華大基因科技有限公司構建，項目編號F16FTSNCKF1028_THEiotE），根據已知的序列信息和GenBank登錄號比對至文庫中以尋找EsABCG25，并通過用RSEM（RNA-Seq by expectation maximization）策略進行基因的表達定量［32］。表達定量的結果以FPKM值表示。FPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因差異表達。用TopHat［33］軟件對EsABCG25在轉錄過程中的可變剪接事件進行分析。

1.2.6 逆境脅迫下EsABCG25的Real-time PCR分析 以鹽芥的Tublin作為內參基因，對不同樣品的cDNA模板上樣量進行均一化。根據Real-time PCR引物設計原則，設計EsABCG25的特異性引物（Tubulin-F：5'-GCCAATCCGGTGCTGGTAACA-3'和Tubulin-R：5'-CATACCAGATCCAGTTCCTCCTCCC-3'；EsABCG25F：5'-GGGAACGGAGAGGCGATAT-3'和EsABCG25R：5'-AAGTTTAATACGCCTCAAAGCCA-3'）

2 結果

2.1 EsABCG25的克隆

以擬南芥AtABCG25序列為查詢序列，通過BLAST比對篩選鹽芥EST序列并進行拼接，根據拼接序列設計上、下游引物，以鹽芥cDNA為模板進行PCR擴增，獲得大小約為2.1 kb的特異產物（圖1）并進行測序。該基因的DNA序列以及預測其編碼的氨基酸序列已登錄至GenBank，登錄號為KY111263。

圖1 鹽芥EsABCG25的擴增

2.2 EsABCG25的生物信息學分析

測序分析表明EsABCG25的cDNA全長為2154 bp，與擬南芥AtABCG25比對，發現EsABCG25含有完整編碼區。在起始密碼子ATG上游含有78 bp的非編碼區，終止密碼子TAA下游含有90 bp的非編碼區，開放閱讀框（Open reading frame，ORF）為1983 bp。根據該基因序列與鹽芥染色體核酸序列的BLASTN結果，確定該基因位于鹽芥第5染色體上第21935011至第21941152個核苷酸區域（圖2-A），包括整個編碼區在內全長為6142 bp。對該基因內含子與外顯子結構分析表明，該基因包含4個外顯子和3個內含子（圖2-B），4個外顯子中各有2個分布在序列的5'端和3'端。上游2個外顯子分別是第1-205個核苷酸（205 bp）和第366-1206個核苷酸（841 bp），下游2個外顯子分別是第4947-5284個核苷酸（338 bp）和第5372-6142個核苷酸（771 bp）。位于基因序列中央的則是長達3740 bp的內含子序列，位于兩側的2個內含子長度較短，均小于150 bp。

圖2 EsABCG25的染色體定位（A）和基因結構（B）

EsABCG25編碼一個含660個氨基酸的蛋白質，分子量為72.6 kD。預測該蛋白分子的理論等電點為9.06，含有20種基本氨基酸，其中含量最高的為亮氨酸（Leu），為13.16%；含量最低的是色氨酸（Trp），為1.06%，酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）總數57個，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）總數69個，氨基酸極性的最大值為10.522，最小值為5.600。疏水性分析（圖3-A）表明，氨基酸序列中，第642位的苯丙氨酸（Phe）具有最高的分值2.878和最強的疏水性，而第25位的精氨酸（Arg）則具有最低的分值-2.789和最強的親水性，整個氨基酸序列疏水值的平均值為0.209，表示EsABCG25分子有較弱的疏水性，這與具有跨膜結構的ABCG家族成員表現出的特征相近。利用SOPMA工具預測蛋白分子的二級結構，結果（圖3-B）表明，該蛋白分子由37.82%的α-螺旋、23.75%的延伸鏈、11.04%的β-轉角和27.38%的無規則卷曲組成，表明α-螺旋和無規則卷曲是該蛋白質分子的主要二級結構元件。利用SMART數據庫預測該蛋白質分子的二級結構，結果（圖3-C）顯示，EsABCG25分子含有一個核苷酸結合結構域（NBD）以及一個跨膜結構域（TMD），屬于半轉運器，即屬于WBC型。

圖3 EsABCG25編碼蛋白的疏水性分析（A）與二級結構預測（B、C）

2.3 EsABCG25的系統進化分析

通過NCBI Protein Blast數據庫搜索EsABCG25編碼蛋白的同源序列，獲得15種植物的高相似度氨基酸序列。這15種植物的同源序列GenBank登錄號分別為蕪菁（Brassica rapa，XP_009105860.1）、蘿 卜（Raphanus sativus，XP_018457081.1）、 甘藍（Brassica oleracea，XP_013592372.1）、 擬 南芥（Arabidopsis thaliana，NP_565030.1）、 亞 麻薺（Camelina sativa，XP_010428049.1）、 醉 蝶花（Tarenaya hassleriana，XP_010521140.1）、 麻風 樹（Jatropha curcas，XP_012065776.1）、 葡萄（Vitis vinifera，XP_002268373.1）、 可 可（Theobroma cacao，EOY17220.1）、 木 薯（Manihot esculenta，XP_021603498.1）、 木 豆（Cajanus cajan，XP_020210384.1）、 絨 毛 煙 草（Nicotiana tomentosiformis，XP_009604112.1）、木本棉（Gossypium arboretum，XP_017603971.1）、 胡 楊（Populus euphratica，XP_011005152.1）和大豆（Glycine max，XP_003555426.1）。比對結果（圖4）表明，鹽芥EsABCG25的氨基酸序列與蕪菁同源序列相似度最高，達92%，其次為甘藍，相似度為91%；與蘿卜、擬南芥和亞麻薺的同源序列相似度為87%-89%；與醉蝶花同源序列的相似度為79%；與麻風樹、葡萄、可可、木薯、木豆、絨毛煙草、木本棉、胡楊和大豆等植物的同源序列相似性在63%-65%。對上述序列進行多序列比對的結果顯示，EsABCG25含有和其他同源序列一致的1個NBD結構域和1個TMD結構域。NBD結構域較為保守，含有3個高度保守的特征元件，分別為Walker A（GPSGSGKST）、Walker B（LDEPTSGLD）和位于二者間的ABC signature（XSGGERKRVSIA）。

圖4 鹽芥EsABCG25編碼蛋白與其他植物ABCG25的氨基酸序列的相似性對比（部分序列）

采用MEGA5.2的NJ策略構建上述16條同源氨基酸序列的系統進化樹（圖5）。包含鹽芥在內的16種植物均屬于雙子葉植物綱，在聚類上分成兩個大分支。其中一個分支內的7種植物中有6種為十字花科植物：鹽芥EsABCG25與同屬于十字花科的蘿卜、蕪菁、甘藍的同源序列因親緣關系很近而聚在一起，相似性也在89%以上。但在這4種植物的聚類中，其他3種之間相對于鹽芥更加相近；而另外兩種十字花科植物擬南芥和亞麻薺的同源序列相比于前四者在親緣上更加接近；此外，來自白菜花科醉蝶花屬的醉蝶花的同源序列（與EsABCG25相似性為79%），相比于其他科植物，與鹽芥等十字花科植物更接近。另一個分支中，屬于豆科、大戟科等7科的可可、木本棉、胡楊、麻風樹、木薯、葡萄、絨毛煙草、大豆和木豆等9種植物的同源序列聚類在一起，與EsABCG25的相似性均小于65%，親緣上離鹽芥相對較遠。

圖5 鹽芥EsABCG25編碼蛋白與其他植物ABCG25蛋白的系統進化分析

2.4 EsABCG25組織特異性和抗逆性相關表達分析

為了解鹽芥不同部位EsABCG25的表達情況，用正常條件下生長的鹽芥根部、蓮座葉、莖生葉、莖部、花和角果等6種組織RNA構建高通量測序文庫，比對至鹽芥基因和基因組數據庫，通過特定統計學方法，以FPKM值為指標，確定各組織中EsABCG25的表達豐度。如圖6-A，鹽芥植株的6種組織中EsABCG25均有一定程度的表達，其中EsABCG25在莖的表達豐度最高，而蓮座葉中表達豐度最低，前者表達豐度是后者的11倍。

此外，該基因在同為運輸通道的根部中也有較高轉錄水平，約為莖的一半，是蓮座葉的5.5倍。在莖生葉和花當中的表達豐度則較低。用TopHat軟件鑒定EsABCG25在各組織中轉錄時發生的可變剪接事件，結果（圖6-B）顯示，在6種組織中都發現了該基因的可變剪接事件，除莖之外其他5種組織中均鑒定出2個可變剪接事件，類型分別是首個外顯子可變（Alternative first exon）和內含子保留（Intron retention）；而在莖中則只鑒定出首個外顯子可變事件。

圖6 EsABCG25在鹽芥不同組織中的表達情況（A）與可變剪接事件數（B）

為了研究不同逆境脅迫對EsABCG25表達的影響，對4周齡的鹽芥植株分別進行200 mmol/L NaCl，4℃低溫，以及自然干旱等脅迫，此外還實施了50 μmol/L ABA處理。分別提取各處理組及對照組的葉片總RNA，逆轉錄后通過Real time-PCR分析EsABCG25的相對表達水平。結果表明，在不同逆境脅迫處理后，鹽芥葉片EsABCG25表達水平有了不同的變化趨勢。鹽脅迫12 h時，EsABCG25表達水平是正常生長條件下的3.4倍，當脅迫再增加12 h后，基因表達水平回落至正常水平的1.4倍，而鹽脅迫持續至1周后，基因表達持續下調，降到脅迫前水平的80%（圖7-A）。當干旱脅迫達到1周時，EsABCG25表達水平顯著降低，為正常條件下的29%，而持續干旱2周后，其表達又增加至近似于原來程度（圖7-B）；與鹽脅迫不同的是，在4℃條件維持12 h后，EsABCG25的表達出現下調，為脅迫前的56%，但脅迫持續至24 h時，表達水平上升至正常水平的1.7倍，在4℃下生長一周后，表達再次下調至脅迫前的70%（圖7-C）。此外值得注意的是，在ABA處理12 h后，鹽芥葉片EsABCG25的表達水平上升至處理前的8.8倍；持續處理24 h后，該基因表達又恢復至近似正常條件下水平，持續處理至1周，EsABCG25仍保持正常表達水平（圖7-D）。

圖7 EsABCG25在不同脅迫條件下的相對表達水平

3 討論

本研究以擬南芥AtABCG25序列為參照，從鹽芥EST數據庫中獲得了與AtABCG25同源性較高的鹽芥EST拼接序列。這種通過已知的近緣物種同源基因序列，利用生物信息學技術手段，對EST數據進行延伸分析的方法，能夠有效地促進新基因的發現和基因功能的研究。但這種以生物信息學方法獲得的基因信息，須通過分子遺傳學的實驗手段來驗證。本研究中，根據拼接序列設計上下游引物，以鹽芥cDNA為模板，首次克隆出特異性的全長序列并通過測序驗證，將之命名為EsABCG25。鹽芥基因組和EST序列信息的不斷增加和完善，為尋找和克隆更多的鹽芥ABCG成員的基因序列，完善鹽芥ABCG亞家族信息奠定了基礎。在通過高通量測序文庫搜索EsABCG25信息的過程中，發現了另一條與EsABCG25序列相近，但編碼區長度要短得多的 cDNA序 列（1296 bp，XM_006390661）， 對 該cDNA編碼蛋白分子二級結構預測發現，其末端含一個NBD結構域，不含跨膜結構域，其預測功能與EsABCG25相似，二者在結構和功能上的潛在異同有待更多研究。目前已知擬南芥131個ABC家族基因中ABCG亞家族基因有44個［8］。作為擬南芥的近緣物種，鹽芥比前者多2條染色體，考慮到鹽芥具有更強的抗逆性以及ABCG成員廣泛參與植物逆境響應機制的特點［34-35］，鹽芥ABCG亞家族成員在數量和功能上可能會更加豐富，且與鹽芥抗逆境機制的關系會更加密切，有待進一步的挖掘。

EsABCG25二級結構預測結果表明，它含有一個核苷酸結合結構域（NBD）和一個跨膜結構域（TMD），說明其屬于ABCG亞家族的半分子轉運器（WBC型）［9］。這一類轉運器需要以雙分子的形式才能發揮功能。朱璐等［36］對擬南芥ABC轉運蛋白家族的信息和功能分析發現，擬南芥ABCG亞家族中，28個成員屬于WBC型。WBC型可以與自己聚合形成同源二聚體，也可以與其他WBC型成員聚合成異源二聚體。已有研究發現AtABCG11可以形成同源二聚體，而AtABCG12只能與AtABCG11結合為異源二聚體行使轉運功能；AtABCG14只能嚴格的與AtABCG11形成異源二聚體，而AtABCG11可以形成同源二聚體或者和AtABCG9結合成異源二聚體發揮功能［37-40］。EsABCG25為WBC型的半轉運蛋白，也必然以同樣方式發揮功能，因此，需進一步探究其形成二聚體的方式和對象。從而了解其發揮功能的機制。

通過EsABCG25編碼氨基酸序列與其他植物同源序列的比對發現，EsABCG25具有與其他分子高度相似的NBD，包含3個特征元件Walker A、Walker B和ABC signature，這一區域在各植物間是高度保守的。NBD作為核苷酸結合結構域，功能是與ATP結合，為轉運提供能量來源［41］，其高度保守性表明這一功能的普遍性。從進化樹可以看到，來自于不同物種的ABCG25氨基酸序列構成的系統進化樹與傳統的植物學分類相吻合。此外，雖然EsABCG25是以擬南芥AtABCG25為參照基因克隆到的，但進化樹顯示，相對于擬南芥，EsABCG25與同科的另外2種植物蕪菁和甘藍的同源序列相似度更高，而相對地，擬南芥與亞麻薺同源序列最為接近。ABC轉運蛋白中，TMD承擔跨膜功能，是其執行運輸功能的關鍵結構，且參與轉運底物的識別［42］。如ABC家族成員ABCA1是細胞抗砷的關鍵蛋白之一［43］，研究發現該蛋白的特異性抗砷結構位于TMD2的胞外第六α-螺旋環上，構建該區域的缺失突變導致細胞排砷功能顯著下降［44］。根據多序列比對的結果，推測ABCG25在系統進化上的變化有可能來源于變異頻率更高的TMD結構域上，這一區域的變異程度可能導致ABCG25在不同植物中轉運功能與效率上的差異。

對AtABCG25的研究發現其主要分布于擬南芥的維管組織當中，且參與了擬南芥內源ABA的轉運與相關響應機制［19］。通過轉基因構建的AtABCG25過表達突變體植株的葉表面保衛細胞的ABA信號顯著增強，且植株的水分利用效率明顯上升，使擬南芥植株對干旱的耐受性增強［20］。本研究表明該基因在莖和根當中的表達水平非常高，是蓮座葉的數倍。這與Kuromori等［19-20］實驗結果表現出一致性。脅迫表達試驗表明，EsABCG25對于多種逆境均產生不同程度的響應，但對于外源ABA脅迫的響應尤為顯著，且EsABCG25在ABA脅迫的較早期（12 h），表達水平迅速上升，但1 d后，其表達水平又回歸至正常且長期不變，相較于其他脅迫，EsABCG25對于ABA的響應更顯著且更早。這暗示EsABCG25在功能上與AtABCG25的相似性。綜上，推測EsABCG25很可能通過直接參與鹽芥對ABA信號的響應進而引發鹽芥對其他逆境的耐受機制。

可變剪接作為基因轉錄后修飾的一種方式，普遍存在于真核生物中。隨著研究的深入，可變剪接逐漸被認可為一種能夠增加蛋白質結構和功能多樣性的重要機制［45］。目前認為可變剪接通過產生選擇性的蛋白質產物，改變有功能和無功能轉錄本的比率，以及產生空間結構相似的蛋白質參與競爭等方式增加了基因表達多樣性［46］。可變剪接在植物的生長發育和環境適應過程中發揮了重要作用［47-48］。本研究在鹽芥的不同組織中均發現了EsABCG25的可變剪接事件，這些事件使其表達產生不同的結果，其生物學意義有待繼續探討。

鹽芥與擬南芥具有相似遺傳背景并表現出更強的抗逆境能力。EsABCG25作為鹽芥中新的ABC蛋白基因被發現，有必要進一步研究其詳細功能以及其功能在分子水平上的執行機制。

4 結論

從鹽芥中克隆獲得cDNA全長序列2154 bp的EsABCG25（GenBank登錄號 KY111263）。該基因定位于鹽芥第5染色體，全長6142 bp，含有4個外顯子和3個內含子。該基因編碼一個含660個氨基酸的蛋白質，蛋白分子呈現弱疏水性，含有一個NBD和一個TMD結構域，與同科植物蕪菁的同源蛋白親緣關系最近，具有ABCG家族典型特征。該基因在鹽芥莖部表達最為豐富，且在各組織中均有可變剪接事件；同時其表達受到多種逆境的誘導，尤其受脫落酸的明顯誘導，與鹽芥的抗逆性關系密切。