擬南芥熱形態建成中PIF4下游基因研究

汪碩 丁嵐 劉建祥，2 韓佳嘉，2

（1. 復旦大學生命科學學院，上海 200433；2. 浙江大學生命科學學院，杭州 310027）

隨著溫室效應的加劇，近些年全球氣候逐漸變暖，20世紀全球平均氣溫約提高0.6℃［1］，經預測，到2050年平均溫度將可能提高2-5℃［2］。高溫會對植物的生長發育產生直接影響，在較高環境溫度下植物會出現葉片偏下、開花提前及下胚軸伸長等表型，與光形態建成對應，植物在環境溫度升高條件下的一些形態上的改變被稱為熱形態建成（thermomorphogenesis）。現有研究表明，調控這些表型的信號途徑與植物遮蔭下的分子信號途徑多有重疊，表型也十分類似［3］。

光和環境溫度作為最重要的環境信號，極大地影響了植物的生長發育。光敏色素互作因子（Phytochrome interacting factors，PIFs），是一類可以與光受體光敏色素蛋白相互作用的bHLH家族轉錄因子。PIFs在光調控的植物生長發育過程中十分重要，能夠影響植物的下胚軸伸長、幼苗的暗形態建成、促進避蔭反應等［4］。29℃的溫和高溫（mild high temperature）能誘導擬南芥野生型幼苗下胚軸伸長，而PIF4缺失突變體pif4對溫和高溫不敏感，下胚軸幾乎不伸長［4］。隱花素（cryptochrome，CRY）是光裂解酶類似的藍光受體，在擬南芥苗期主要調控其下胚軸伸長。CRY1對溫度響應十分重要，而溫和高溫下CRY1通過與PIF4以藍光依賴的形式相結合，進而調控PIF4在溫和高溫下的轉錄活性［5］。最近，有報道指出光敏色素B（phyB）不僅可作為光的受體，同時能感應環境溫度的變化［6］，但溫和高溫下phyB到PIF4的信號傳遞目前不是很清楚。

另外一條獨立于PIF4的調控植物響應光和溫度信號，控制下胚軸伸長的信號通路包含COP1（CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1）和HY5（ELONGATED HYPOCOTYL 5）。HY5是 bZIP家 族轉錄因子，不但在白光下抑制擬南芥下胚軸伸長，同時在常溫下也能通過與PIF4競爭下游靶標基因啟動子來抑制下胚軸伸長［7］。在黑暗條件下或環境溫度升高后，HY5被泛素連接酶COP1降解，從而解除了HY5 對下胚軸伸長的抑制效果［7-10］。COP1在細胞核中發揮作用，但溫和高溫下COP1如何進核的分子機理目前不清楚。

溫度的升高會使生長素表達水平上升，進而調節下胚軸伸長等植物生長活動［11］。有研究表明當溫度升高時，擬南芥中生長素響應基因表達水平也有所變化［12］。擬南芥在響應溫和高溫時，PIF4能夠直接結合生長素合成基因，如YUC8，TAA1，CYP79B2等基因的啟動子。PIF4通過激活TAA1和CYP79B2基因的表達，進而介導吲哚乙酸（IAA）的合成［13］。而IAA的積累能夠促進AUX/IAA蛋白的降解，進而消除對ARF蛋白的抑制作用。最后ARF通過激活SAUR19等基因的表達促進胚軸伸長［14］。其它植物激素，例如，油菜素內脂BR和赤霉素GA在植物熱形態建成中也發揮著重要的作用［12，15-17］。

本實驗利用擬南芥PIF4缺失突變體和PIF4過表達等材料開展研究。遺傳分析表明，PIF4、PIF5和PIF7中，PIF4在熱形態建成中的作用最重要。通過對RNA-Seq結果和結合CHIP-Seq分析找到了擬南芥熱形態建成中PIF4調控的下游基因以及結合靶標基因。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所使用的植物材料有擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia生 態 型（Col-0）， 擬 南 芥Columbia背景突變體pif4-101，擬南芥野生型背景下PIF4∶PIF4-myc轉基因植株，擬南芥pif4-101背景下PIF4∶PIF4，PIF4∶PIF5，PIF4∶PIF7轉基因植株。所使用的菌株有大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10， 農 桿 菌 菌 株（Agrobacterium tumefaciens）GV3101。這些材料均為本實驗室獲得和保存。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的平皿培養 將同批收獲的種子放于1.5 mL離心管中，用1 mL 體積比為50%的酒精迅速清洗1次，用體積比0.3%的NaClO消毒15 min后，于超凈臺內用無菌水清洗3次，播種在含質量濃度1.2%蔗糖的1/2MS固體培養基上。4℃春化2-3 d后置于22℃光照培養箱，光16 h/暗8 h。

1.2.2 下胚軸長度測量和分析 將相應材料于22℃培養4 d后，在第5天光照開始時移至29℃培養4 d，以22℃培養的植物作為對照。用相機分別拍下對應天數的不同材料的擬南芥幼苗生長照片，利用ImageJ軟件進行數據測量分析。

1.2.3 RNA-Seq 擬南芥Columbia野生型（wild-type，WT）和pif4-101突變體4℃春化2 d后于22℃培養7 d。在光照開始時將幼苗移至29℃處理1 d，以22℃培養的植物作為對照。于黑暗周期結束后收集擬南芥幼苗用于RNA-Seq。根據Illumina標準步驟構建cDNA文庫，Illumian Hiseq3000測序（晶能公司）。GO 分析采用 AgriGO（v2.0）進行分析［18］。

1.2.4 染色質免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）分別將擬南芥Columbia野生型及PIF4∶PIF4-myc轉基因植株于22℃培養，第12天29℃處理24 h，以22℃培養的植物作為對照。用甲醛固定液固定，后用2.5 mol/L甘氨酸解交聯，MilliQ水清洗材料3次。去除水分，凍于-80℃保存。將材料用液氮研磨成粉末，加入30 mL EB1，用2層Miracloth過濾。離心后用1 mL EB2重懸，離心并用300 μL EB3重懸沉淀，并覆蓋于600 μL EB3上。離心并用300 μL NLB重懸沉淀，使用biorupt進行超聲，超30 s停30 s。離心取部分上清做Input。其余每個重復加入50 μL protein A beads去除與beads的非特異性結合。取上清加入2 μg myc抗體，于4℃旋轉過夜。次日加protein A beads 110 μL，4℃ 2 h 后低速離心留 beads。分別用低鹽、高鹽和LiCl和TE緩沖液清洗beads。分兩次加入300 μL 洗脫緩沖液65℃煮15 min，合并。用洗脫緩沖液將Input補齊到500 μL，與免疫沉淀后的DNA-蛋白復合物一起于65℃解交聯約6 h。用蛋白酶K去除蛋白，RnaseI去除RNA。沉淀DNA，并用無水乙醇及70%乙醇清洗沉淀，晾干后用無菌水溶解。

以MYC抗體沉淀的DNA為模板，進行qPCR擴增，以actin啟動子序列作為陰性對照。qPCR實驗 使 用 SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa） 試 劑，在Bio-Rad CFX96TM儀器上完成。反應體系按照TaKaRa及Bio-Rad CFX96TM儀器配制。得到數據后分析處理并作圖。

1.2.5 實時熒光定量PCR實驗（qRT-PCR） RNA提取使用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN），總RNA保存于-80℃。cDNA使用 M-MLV（TaKaRa）反轉錄得到，保存在-20℃。

qRT-PCR實驗使用SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）試劑，在Bio-Rad CFX96TM儀器上完成。反應體系按照TaKaRa及Bio-Rad CFX96TM儀器配制。得到數據后分析處理并作圖。

2 結果

2.1 PIF4在擬南芥熱形態建成中的主要生物學功能

本實驗在擬南芥PIF4突變體pif4-101背景下采用PIF4自身啟動子分別回補PIF4、PIF5和PIF7，利用這3種互補遺傳材料來研究PIF4及同源蛋白在擬南芥熱形態建成中的生物學功能的區別。野生型擬南芥和pif4-101、PIF4∶PIF5、PIF4∶PIF7在22℃生長8 d后，4種材料的幼苗下胚軸長度基本一致（圖1-A），而PIF4∶PIF4的下胚軸則明顯長于其他材料。而在22℃生長4 d、29℃生長4 d的條件下，PIF4∶PIF4的下胚軸伸長更長，野生型和PIF4∶PIF5的下胚軸比22℃時伸長的幅度接近，而pif4-101、PIF4∶PIF7則幾乎不伸長（圖1-B）。

基因表表達分析（圖1-C）表明，PIF4∶PIF4植物中正常條件下PIF4表達量比野生型中高，可能是PIF4∶PIF4植物正常溫度條件下下胚軸比較長的原因。這些結果表明，擬南芥熱形態建成中PIF7的功能較小，PIF5也具有PIF4類似的功能，但PIF4的功能明顯比PIF5的功能強。因此，PIF4在擬南芥熱形態建成中具有重要的功能。

圖1 PIF4突變體的表型遺傳互補分析

2.2 熱形態建成中PIF4調控的下游基因

為了在全基因組水平上理解熱形態建成過程中PIF4調控的下游基因表達，將擬南芥野生型和突變體pif4-101在22℃ 培養7 d后，于光周期中白光開始時用29℃處理24 h，在黑暗結束后取樣，以不處理的植物作對照，收集幼苗全苗進行轉錄組測序（RNA-Seq）。對轉錄組數據進行統計分析后顯示，在擬南芥野生型與pif4-101中分別有602個基因和512個基因受溫和高溫處理上調，并有529個基因和484個基因受溫和高溫處理下調。其中有248個基因只在野生型中特異上調，198個基因只在野生型中特異下調（圖2，附表）。

圖2 PIF4突變體與野生型熱處理的RNA-SEQ分析

對于這些只在野生型中上調的248基因，我們認為它們是PIF4依賴的熱響應基因。GO分析（圖3）顯示，PIF4依賴的熱響應基因中主要參與脫落酸響應、生長素響應、幾丁質響應、脫水響應、鹽脅迫、冷馴化等過程。綜上所述，這些結果表明，PIF4依賴的熱響應基因主要參與植物激素信號通路和逆境應答。

對于354個在野生型和突變體pif4-101中上調的下游基因，對其上調幅度也進行了比較。結果（表1）顯示，有21個基因在pif4-101突變體中的上調倍數是野生型（WT）中上調倍數的1/2及以下，我們把這些基因視作是部分依賴PIF4調控的熱形態建成基因。

2.3 熱形態建成中PIF4調控的結合靶標基因

圖3 PIF4依賴的熱響應基因GO分析

表1部分依賴PIF4調控的熱形態建成基因

為了檢測上述PIF4依賴和部分依賴的基因是否是PIF4的直接靶標基因，我們在擬南芥野生型背景下過表達myc標簽融合的PIF4-myc材料（PIFox）。野生型WT和PIF4ox-5、PIF4ox-8轉基因材料在22℃正常生長8 d后，PIF4過表達轉基因材料表現出下胚軸變長的表型。在22℃生長4 d后移入29℃培養4 d，野生型的下胚軸出現一定程度的伸長，PIF4過表達轉基因材料下胚軸伸長現象更加明顯（圖4）。這表明PIF4過表達材料正常溫度下可能已經激活部分下游基因，并且能響應環境溫度升高的變化，這些材料可以用于后續結合靶標基因的實驗。

圖4 PIF4過表達的表型分析

在研究植物激素BR調控下胚軸伸長過程時，王志勇課題組采用pifq四突變體背景下自身啟動子驅動的PIF4-myc過表達材料，正常生長條件下進行染色質共免疫沉淀深度測序（ChIP-Seq）分析，得到4583個候選的PIF4結合靶標基因［15-16］。

為了研究熱形態建成中PIF4的結合靶標基因，我們比較了上述248個PIF4依賴的基因以及PIF4候選的結合靶標基因，得到70個熱形態建成過程中被PIF4結合的候選靶標基因。

我們隨機選擇了7個靶標基因，包括AT1G29395（COR413IM1）、AT1G73120（F-box 蛋白 ）、AT2G47780（LDAP2）、AT3G28857（PRE5）、AT4G14130（XTR7）、AT5G07010（ATST2A）、AT5G18050（SAUR22），利用PIF4-myc過表達材料（PIFox-5）進行ChIP-qPCR實驗。結果（圖5）表明，AT1G29395、AT3G28857、AT5G18050這 3個基因的啟動子區域在正常溫度下就可以被PIF4-myc富集（≥1.5倍，P ＜ 0.05），在環境溫度升高后7個候選靶標基因中，6個基因（AT1G29395、AT1G73120、AT2G47780、AT3G28857、AT5G07010、AT5G18050）的啟動子區域被PIF4-myc富集（≥1.5倍，P ＜ 0.05），說明通過生物信息分析得到的70個PIF4結合靶標基因中絕大部分為實際PIF4結合靶標基因（附表）。

圖5 PIF4體內結合下游基因啟動子的分析

我們也比較了上述21個PIF4部分依賴的基因以及PIF4候選的結合靶標基因，得到4個PIF4熱形態建成過程中被PIF4結合的靶標基因（表1）。我們把這74個PIF4結合靶標基因視作熱形態建成中PIF4結合的靶標基因，這些靶標基因是否被PIF4直接結合可以采用凝膠遷移EMSA實驗進行證明。

2.4 PIF4過表達對下游基因的影響

為了研究PIF4過表達對下游基因表達的影響，將野生型（WT）和PIF4-myc過表達材料（PIF4ox-5）進行不同溫度處理，檢測以上提到的7個基因的表達情況。結果（圖6）表明，6個 基 因（AT1G29395、AT1G73120、AT2G47780、AT3G28857、AT4G14130、AT5G18050）正常溫度下PIF4ox-5中的表達量高于野生型中的表達量，只有1個基因（AT5G07010）在溫和高溫處理后PIF4ox-5中表達量才高于野生型中的表達量。

圖6 PIF4過表達對下游基因表達的影響

3 討論

bHLH家族轉錄因子PIF4與關敏色素phyB互作，參與植物光形態建成，后續更多的研究表明，PIF4是植物熱形態建成中的重要調控節點［19-23］。我們的實驗結果也表明，在幾個PIFs中，PIF4在植物熱形態建成中功能最重要。PIF4基因的表達受時鐘的調控，同時也受溫和高溫的誘導［20，24］。PIF4蛋白也受到翻譯后修飾調控。例如，在白光下phyB和BIN2可以磷酸化PIF4，導致PIF4的降解［25-26］。環境溫度升高后磷酸化的PIF4積累［27］，這主要與DET1穩定PIF4有關［7］。此外，PAR1和CRY1也可以與PIF4互作，溫和高溫下抑制PIF4 的轉錄活性［5，28-29］。

PIF4的靶標基因中有很多是植物激素合成和響應基因［12，15］，因此一般認為PIF4在熱形態建成中主要通過植物激素，如生長素途徑發揮作用［11，23］。事實上，生長素合成基因比如YUC8和生長素響應基因比如IAA4 和IAA29，受溫和高溫的誘導上調并且依賴于PIF4［13，20］。但是，PIF4在全基因組水平的熱形態建成中的下游基因并未見報道。我們采用RNA-Seq的方法，得到了溫和高溫處理后受PIF4調控的269個下游基因（包括21個PIF4部分依賴的下游基因）。這些基因中生長素響應途徑的基因（IAA6、IAA19、IAA34、SAUR22、SAUR57、SAUR59）和脫落酸響應途徑的基因得到顯著富集。此外，一些細胞壁伸長相關基因和逆境脅迫響應基因也得到富集。我們的結果為理解植物熱形態建成的基因調控提供了幫助。

這些PIF4調控的熱形態建成下游基因中，據估算大約有25%為熱形態建成中PIF4調控的結合靶標基因，其他為PIF4間接調控的下游基因。例如，編碼膜蛋白COR413IM1的基因AT1G29395被證明是PIF4的直接調控基因。溫和高溫處理下的該基因的誘導表達依賴于PIF4，野生型中組成性表達PIF4正常溫度下該基因上調表達。而編碼細胞壁成分、改變有關的木葡聚糖內糖基轉移酶XTR7的基因AT4G14130并不被PIF4直接結合，是PIF4間接調控的下游基因。溫和高溫處理下該基因的誘導表達也依賴于PIF4，野生型中組成性表達PIF4正常溫度下該基因也上調表達。

此外，PIF4對下游靶標基因的結合能力也有差別，當PIF4組成性表達后，有的靶標基因在正常溫度下就可以被PIF4結合，而有些靶標基因只有在溫和溫度處理后才被PIF4結合。例如，編碼磺基轉移酶ATST2A的AT5G07010啟動子只有在溫和高溫處理下才顯著被PIF4結合。溫和高溫處理下該基因的誘導表達依賴于PIF4，野生型中組成性表達PIF4，正常溫度下該基因沒有上調表達，但溫和高溫處理后該基因明顯誘導表達。這些結果暗示其他的溫和高溫處理依賴的轉錄調控因子可能與PIF4一起調控了該基因的表達。PIF4過表達植物正常條件下下胚軸伸長，溫和高溫下有進一步的伸長，而在檢測的7個基因中，只有1個基因（ATST2A）的表達量在PIF4過表達植物中溫和高溫下有進一步上調表達，說明一部分PIF4調控基因在溫和高溫下對下胚軸的伸長非常重要。

4 結論

獲得擬南芥熱形態建成中248個PIF4完全依賴和21個PIF4部分依賴的下游基因，這些下游基因主要參與植物激素和非生物逆境響應。這些PIF4調控的熱形態建成下游基因有74個基因是PIF4結合靶標候選基因。選擇7個PIF4候選靶標基因，有6個基因被PIF4直接結合。

注：本論文中附表見電子版（http://biotech.caas.cn）