GA與B9對馬鈴薯種薯生長發育的影響

何依雪 劉文 沈祥陵

（三峽區域植物遺傳與種質創新重點實驗室（三峽大學）湖北省三峽特色植物繁育工程技術研究中心 三峽大學生物技術研究中心，宜昌 443000）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬于茄科多年生草本植物，塊莖可供食用，是全球第四大重要的糧食作物，僅次于小麥、稻谷和玉米。由于馬鈴薯在生產中長期采用無性繁殖，病毒積累危害，造成馬鈴薯產量和質量下降。利用植物莖尖分生組織培養技術獲得馬鈴薯脫毒苗，將脫毒苗進行組織培養獲得的種薯為脫毒試管薯［1］。試管薯因其無病毒感染，不受季節影響，易儲存等優點已成為繼脫毒試管苗之后保存種質和生產無毒種薯的一種新形式。但是目前脫毒試管薯的應用面積比例并不大，主要是存在試管薯誘導效率低，成本較高，結薯小不能滿足生產需要等問題。

馬鈴薯塊莖形成受到諸如光照、溫度、氮素等多種外界因子的影響，其中短日照（Short day，SD）對誘導馬鈴薯塊莖形成有非常重要的影響［2］，實驗證明SD誘導植株產生的塊莖形成刺激物質可通過嫁接傳遞［3］，所以植物生長調節物質成為探究馬鈴薯種薯生長發育的重要組成部分。胡云海等［4］發現生長素IAA和NAA能促進微型薯個數和重量的增加。眾多研究表明赤霉素（Gibberellin，GA）對馬鈴薯塊莖形成有抑制作用，內源GA水平的降低是馬鈴薯匍匐莖膨大的重要因素［5］。由于馬鈴薯組培苗繼代之后容易出現弱化、叢生等現象，多效唑、丁酰肼等植物生長抑制劑被廣泛用于馬鈴薯組培苗的壯苗。丁酰肼（B9），為低毒性植物生長抑制劑，化學式C6H12N2O3，是GA的生化合成抑制劑［6］。實驗表明，B9對馬鈴薯種薯的生長發育有促進作用［7］，說明GA的抑制劑可以促進馬鈴薯種薯形成。但是2017年 ?ev?íková等［8］利用 UHPLC-MS/ MS 分析馬鈴薯自發結薯突變體內的GAS含量，結果表明，在突變體結薯期間GAS的含量遠高于普通馬鈴薯，并對GA抑制馬鈴薯塊莖形成的作用提出懷疑。因為組織培養實驗結果也證明GA會抑制馬鈴薯試管薯形成，所以并未對此結果下定論。但是Yamaguchi［5］、宿飛飛［7］、?ev?íková等［8］的組織培養方法是單獨施加GA或者B9來探究激素對于馬鈴薯的影響，此實驗方法只能單一的探究GA含量增長或者降低對馬鈴薯的影響，所以得出的結論不能準確反映GA對于馬鈴薯種薯生長發育過程的影響。本研究通過在培養基中同時添加不同濃度的GA與B9，并觀察測量馬鈴薯薯種的變化，來探究GA和B9對馬鈴薯生長發育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：馬鈴薯“Desiree”。試劑：MS粉末（Phyto Technology），蔗糖（科密歐），瓊脂（Solarbio），Ca（NO3）2（SIGMA），可溶性淀粉（科密歐），I2（麥克林），IK（國藥）。

1.2 方法

1.2.1 試管苗的培養 用MS+3%蔗糖+1%瓊脂（MS3）培養馬鈴薯莖段，將脫毒馬鈴薯苗剪段插瓶培養至馬鈴薯苗生長良好，一株可繼代出5-6株，為后續實驗做準備。1.2.2 激素的施用 基本培養基為MS培養基，使用不同濃度的GA和不同濃度的B9做成4×4的正交實驗（表1）。將馬鈴薯剪成5 cm長的莖段，每瓶5個莖段，1株頂芽，4株側芽（每株側芽帶一片葉一個腋芽點），每種培養基一共栽種40株。

表1 馬鈴薯培養基編號

每周統計每株馬鈴薯的株高，側芽數，葉片數（除頂芽部分），第4周以后由于株高生長到培養瓶頂端，會影響測量的準程度，所以停止對株高的測量。第8周開始對馬鈴薯側芽，馬鈴薯結薯數，薯重進行統計。

1.2.3 淀粉含量的測定 利用徐昌杰等［9］的方法繪制淀粉含量標曲，測定16種培養基中馬鈴薯塊莖的淀粉含量。

1.2.4 數據分析 利用SPSS軟件對數據進行分析，利用GraphPad Prism 6作圖。

2 結果

2.1 GA與B9對馬鈴薯外形的影響

馬鈴薯植株栽種進培養基到長成植株的8周后，觀察每種培養基中的馬鈴薯植株的外觀，進行統計（表 2）。

添加B9的馬鈴薯植株葉片寬大，莖稈粗壯，但是株高較矮，添加GA的馬鈴薯株高較高，側芽較多，但是葉片細小，莖稈細弱，GA與B9同時添加時，馬鈴薯葉片寬大，莖稈粗壯，株高正常，側芽較多但是側芽粗壯成型（圖1）。

2.2 GA與B9對馬鈴薯株高的影響

2.2.1 GA與B9對于馬鈴薯總株高的影響 GA會促進馬鈴薯植株長高，GA濃度為1.0 mg/L，B9濃度為0 mg/L時馬鈴薯苗最高。B9對馬鈴薯株高的影響則正好相反，B9濃度為40 mg/L，GA濃度為0 mg/L最矮。GA與B9對馬鈴薯的共同作用則顯示（圖2-A），在GA濃度相同時，B9的濃度越高株高越矮；B9濃度相同時，GA濃度越高，株高越高。

2.2.2 GA對馬鈴薯側芽高度的影響 GA對馬鈴薯株高有促進作用，但是GA對于頂芽和側芽的影響卻存在差異，在施加相同濃度的GA時，馬鈴薯側芽高度要大于頂芽，施加0.1 mg/L GA+0 mg/L B9的培養基中，側芽與頂芽的差值最高。在GA濃度相同時，施加B9的培養基上生長會縮短頂芽高度的差距（圖2-B）。

表2 不同激素濃度對馬鈴薯外形的影響

圖1 不同培養基對馬鈴薯外形的影響

2.2.3 GA與B9對馬鈴薯每段莖節高度的影響 根據對馬鈴薯葉片數（除頂芽）的統計，不同培養基之間的葉片數相差不大（圖2-C），但是由于總株高有差異，所以每一段莖節的高度［莖節高度（cm）=株高（cm）/葉片數（除頂芽）］就有差異，可見隨著GA濃度的增高，每一莖節的高度逐漸增高。添加B9可以縮短馬鈴薯每段莖節高度（圖2-D）。

2.3 GA與B9對馬鈴薯側芽的影響

當B9濃度為0 mg/L時，各種GA濃度下側芽數都高于同組的其他值。其中施加GA濃度為0.5 mg/L時，側芽數最高。施加B9之后側芽數就會顯著降低（圖2-E）。當B9濃度為0 mg/L時，在各種GA濃度下側芽的發生率［側芽發生率（%）=側芽數/葉片數（除頂芽）×100%］都達到80%以上，其中當施加GA濃度為0.5 mg/L時，側芽發生率達到91.67%。而對照組的側芽發生率只有56.06%。在同一個GA濃度下，施加B9會減少側芽的發生率（圖2-F）。

2.4 GA與B9對馬鈴薯結薯的影響

馬鈴薯試管苗在生長后期會產生種薯，不同部位的種薯形狀與長勢不同。根部長出的種薯數量多，全部在培養基中發育，但是顆粒小，無法長大，也沒有芽點；莖部長出的種薯數量偏少，部分在培養基中發育，部分在空氣中發育，顆粒大，有芽點可以再生成馬鈴薯植株，所以對莖部長出的馬鈴薯進行統計。

在第80天統計馬鈴薯莖部的結薯情況，隨著B9濃度的增加，馬鈴薯的結薯率逐漸增加，但是最高不超過0.5個/株，單獨添加GA的培養基中結薯率都在0.2個每株上下，但是GA和B9同時添加時，馬鈴薯的結束率增大到0.8個/株，最高能達到1.33個/株。其中，第6，7，10號培養基的馬鈴薯結薯率達到了1.2個馬鈴薯每株，遠高于對照組0.2個/株（圖3-A）。

圖2 GA與B9對馬鈴薯株高，側芽，葉片的影響

將所的的所有馬鈴薯進行重量統計，只添加GA的馬鈴薯塊莖均重在GA濃度為0.5 mg/L時最大，為180.19 mg；只添加B9的馬鈴薯塊莖均重在濃度為20 mg/L時最大，為131.75 mg；GA和B9同時添加時，培養基中激素組合為0.1 mg/L GA+20 mg/L B9，0.1 mg/L GA+40 mg/L和 0.5 mg/L GA+40 mg/L B9時，馬鈴薯塊莖均重達到200 mg以上，其中0.1 mg/L GA+20 mg/L B9的激素濃度組合馬鈴薯均重最大達到351 mg（圖3-B）。

將馬鈴薯薯重做成箱圖（圖4）顯示，部分數據離散程度很大，不夠集中，如6號、7號培養基所得的馬鈴薯薯重；而5號、16號培養基馬鈴薯薯重雖然集中但均重不大。

2.5 GA與B9對馬鈴薯淀粉含量的影響

用可溶性淀粉制作淀粉含量的標準曲線，得到標準曲線y = 0.1621x-0.0027，R2=0.99902。通過對不同激素組合的培養基中收取的馬鈴薯進行淀粉含量的測量，利用標曲和計算公式計算出馬鈴薯中的淀粉含量（mg/g）。對數據的單因素方差分析顯示，施加0.5 mg/L GA時，馬鈴薯淀粉含量最高，但與0 mg/L和0.1 mg/L GA沒有顯著性差異，但是1.0 mg/L GA會對馬鈴薯淀粉含量有抑制作用，且與其他組有顯著性差異。

施加40 mg/L B9會降低馬鈴薯中的淀粉含量（圖5-A）。對16種培養基中馬鈴薯種薯淀粉含量測定表明添加0.5 mg/L GA+0 mg/L B9時馬鈴薯種薯淀粉含量最高，1.0 mg/L GA+40 mg/L B9馬鈴薯種薯淀粉含量最低（圖5-B）。

3 討論

圖3 GA與B9對馬鈴薯結薯的影響

圖4 GA與B9對馬鈴薯薯重離散程度的影響

圖5 馬鈴薯淀粉含量的測定

研究表明，多種激素參與調控馬鈴薯種薯的形成［4-5，7］，GA在馬鈴薯種薯生長發育中的作用很早就被發現，Vreugdenhil［10］和連勇等［11］認為 GA3對馬鈴薯的塊莖形成有抑制作用。且GA被認為在馬鈴薯種薯形成過程起著主導作用，其他植物生長調節劑是改變GA的水平來影響種薯的生長發育［12］，SD誘導塊莖形成的作用也被認為是與其調節植株組織中GA含量降低有關［13］。但在對SD誘導種薯形成機制的探究過程中發現GA對馬鈴薯塊莖形成也可能有促進作用［14］。

表3 馬鈴薯結薯量的方差分析

表4 馬鈴薯莖，葉，芽的方差分析

表5 馬鈴薯淀粉含量的方差分析

本實驗通過施加GA與B9探索這兩種植物生長調節物質對馬鈴薯種薯生長發育的影響，發現GA與B9同時使用對馬鈴薯種薯的形成有顯著的影響。在結薯率方面，當GA與B9同時使用時，馬鈴薯結薯數明顯大于單獨使用GA和B9（圖3-A）。當只施加低濃度的GA時，馬鈴薯塊莖形成會受到抑制，但同時施加B9后塊莖形成會被促進，說明馬鈴薯塊莖形成需要一定量的GA參與，也需要GA的抑制劑抑制其功能。這一結果看似矛盾，但是卻反映出GA對馬鈴薯塊莖形成的影響不是單一的促進或者抑制，而是一個必要的且作用量存在峰值的過程。這可以印證許珍等［14］提出的GA對馬鈴薯塊形成可能有促進作用，也印證了 ?ev?íková等［8］發現的在自發結薯馬鈴薯突變體結薯期GAs含量會明顯增多的現象。在薯重方面，不同的培養基得到的馬鈴薯薯重也不同，由于1號、15號培養基只收到3個馬鈴薯無法制作箱圖舍去。其中7號，8號，12號馬鈴薯薯重明顯大于其他培養基（圖3-B），但是馬鈴薯薯重的數據離散程度很大，其中7號培養基結的馬鈴薯最大達到1000.3 mg，但其他馬鈴薯重量偏低，所以雖然7號培養基馬鈴薯均重大，但數據不集中（圖4-C）。這可能是由于馬鈴薯植株之間的變異程度大，同一品種的馬鈴薯植株之間可能存在差異［15］。

除了馬鈴薯的結薯率和薯重，實驗中也探究了GA與B9對馬鈴薯植株株高、側芽及葉片的影響，發現GA對馬鈴薯株高，葉片數，莖段高，側芽數，側芽發生率，側芽頂芽差都有極顯著的影響；B9對葉片數的影響不如GA顯著；GA與B9的交互作用對馬鈴薯的株高是沒有影響的，對葉片數，莖段數，側芽數，側芽發生率，側芽頂芽高度差都有極顯著的影響的（表4）。表明GA會促進馬鈴薯莖稈的伸長，側芽的增多，馬鈴薯塊莖的形成是馬鈴薯匍匐莖莖段膨大的結果，所以側芽數多可能是提高馬鈴薯結薯率的因素，但是，添加GA的馬鈴薯植株后期葉片弱小，莖稈細弱，這可能會影響馬鈴薯的光合作用，影響馬鈴薯的生長，從而影響馬鈴薯的結薯率。添加B9會使馬鈴薯莖稈粗壯，葉片寬大，但是會減少側芽的發生率，所以這也可能是單獨添加B9的促進效果不如B9和GA同時添加的效果顯著的原因。

馬鈴薯塊莖中約有20%的干物質，大部分由淀粉組成［16］，所以淀粉含量是評價馬鈴薯質量的重要指標。馬鈴薯淀粉在工業加工、食品行業、房屋筑造等行業都有廣泛的應用［17］。并且馬鈴薯淀粉的許多特性指標都已成為行業內的參考標準［18］。已有研究證明GA3處理的葡萄果實前期會有淀粉的累積［19］，施用GA會增加小麥中的淀粉含量［20］，提高ABA與GA的比值，有助于灌漿初期水稻籽粒中淀粉的累積［21］。說明GA對植物中淀粉含量的累積是有影響的。通過實驗發現一定濃度的GA會促進馬鈴薯塊莖淀粉含量的累積，但是高濃度的GA會降低馬鈴薯塊莖的淀粉含量（表5），這有可能是由于GA會提升α-淀粉酶的活性，高濃度的GA促使α-淀粉酶將淀粉轉換成可溶性糖，將馬鈴薯塊莖中的淀粉合成和降解的平衡打破，加速淀粉降解［22-23］。

馬鈴薯種薯的生長發育是一個復雜的過程，受多種調控途徑調控。本實驗對GA與B9對馬鈴薯種薯生長發育的影響進行了探究發現，同時施用兩種激素會大幅度提高馬鈴薯的結薯率，但是GA對馬鈴薯結薯影響的分子機制仍需要進一步探究。

4 結論

通過在馬鈴薯培養基中添加不同濃度的GA3和B9，對馬鈴薯的生長過程中莖，葉，芽，種薯進行觀察統計，發現0.5 mg/L GA與20-40 mg/L B9同時作用時馬鈴薯植株生長良好，馬鈴薯種薯結薯最多，淀粉含量最高。