蔗糖，GA與液體培養基對馬鈴薯塊莖形成的影響

何依雪 劉文 沈祥陵

（三峽區域植物遺傳與種質創新重點實驗室（三峽大學）湖北省三峽特色植物繁育工程技術研究中心 三峽大學生物技術研究中心，宜昌 443000）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是全球第四大糧食作物，糧菜兼用，具有營養豐富、生長季節短、儲運方便等特點［1-3］。馬鈴薯以無性繁殖為主，在繁殖中病毒積累會導致產量和品質下降，但隨著植物組織培養技術的發展，利用組織培養脫毒試管薯技術從根本上解決了馬鈴薯的品種退化問題［4-5］。在馬鈴薯試管薯誘導研究中已發現光周期［6］、大量元素組合［7］、多種激素［8］、蔗糖濃度［9］和培養基類型［10］都對馬鈴薯試管薯的形成有影響。馬鈴薯塊莖的形成是匍匐莖的生長及其頂端的膨大，以及塊莖內淀粉的合成和貯藏蛋白的積累的結果，所以培養基內的糖類物質和激素水平成為研究試管薯形成的重要原因。

蔗糖是植物葉片光合作用的主要產物，在成熟葉片合成以后除了供應自身代謝以外還運輸到植物的各種異養組織利用與貯藏［11］。蔗糖除了為植物生長過程中提供必要的能源物質外，同時也是參與植物生長發育的一種重要的信號分子，例如參與調節植物的細胞周期、基因表達［12-13］。蔗糖對馬鈴薯塊莖形成的影響之前已經有了一些研究成果。將馬鈴薯種植在大棚中裝有河沙的桶內，分別用0、4%、8%蔗糖澆灌，發現8%蔗糖澆灌條件下馬鈴薯植株的結薯數量以及塊莖干物質量明顯高于0%蔗糖的處理和4%蔗糖處理［14］；霍鳳玲等［15］在馬鈴薯試管苗的培養基中添加高濃度的蔗糖誘導會使馬鈴薯結薯增多。由此表明高濃度外源蔗糖對馬鈴薯田間培養和試管培養均具有促進塊莖形成的作用。

早在20世紀50年代，就有人對外源添加GA對馬鈴薯生長和塊莖形成的影響進行了研究。幾乎所有報道都一致認為，GA促進了馬鈴薯整株或離體莖、葉和匍匐莖的生長，但抑制或延緩了塊莖的形成［16］，認為光周期與溫度對結薯的影響其實是對馬鈴薯內源GA水平的調控的結果［17-18］，并且其他激素對于馬鈴薯塊莖形成的影響也是由于改變了GA的水平造成的［9］。本實驗選取蔗糖濃度，GA濃度和培養基類型三種因素進行正交試驗，研究馬鈴薯試管薯結薯的最優培養基。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：馬鈴薯“Desiree”。試劑：MS粉末（Phyto Technology），蔗糖（科密歐），瓊脂（Solarbio），赤霉素（北京振泰），葡萄糖（科密歐），果糖（阿拉丁）。

基本MS培養基配方：MS粉末：4.43 g/L，蔗糖：30 g/L，瓊脂：10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 試管苗的培養 用MS+3%蔗糖+1%瓊脂（MS3）的培養基培養馬鈴薯莖段，將脫毒馬鈴薯苗剪段插瓶培養至馬鈴薯苗生長良好，一株可繼代出5-6株，為后續實驗做準備。

1.2.2 不同糖類對馬鈴薯組培的影響 基本培養基為MS培養基，分別添加3%的葡萄糖、果糖和蔗糖。將馬鈴薯剪成5 cm長的莖段，每種培養基接種15株馬鈴薯。45 d后統計馬鈴薯的結薯個數和薯重。

1.2.3 蔗糖、GA與培養基種類對馬鈴薯的影響 基本培養基為MS培養基，利用蔗糖濃度，GA濃度，培養基類型3種因素制作正交實驗表格如表1。將馬鈴薯剪成5 cm長的莖段，每種培養基接種30株馬鈴薯。在第35天、60天和95天分別統計馬鈴薯的結薯個數和95 d的單薯重。

表1 正交實驗設計

1.2.4 數據分析 利用SPPS軟件對數據進行分析，利用GraphPad Prism 6作圖。

2 結果

2.1 糖的種類對馬鈴薯結薯的影響

培養基中添加3種不同的碳源、葡萄糖、果糖和蔗糖，45 d后統計結薯數量，蔗糖結薯量最高，達到0.46個/株，葡萄糖最低，只有0.2個/株（圖1-A）。稱量收獲的馬鈴薯重量，均重最大的是添加葡萄糖的培養基，達到89 mg（圖1-B），但3組數據沒有顯著性差異。

2.2 蔗糖、GA和培養基種類對馬鈴薯結薯的影響

2.2.1 對馬鈴薯植株的影響 在培養基中添加不同濃度的蔗糖和GA會使馬鈴薯的外形受到影響，隨著蔗糖濃度的升高，馬鈴薯植株的株高逐漸變矮（圖2-A）。培養基類型對馬鈴薯培養基中的匍匐莖有影響，在液體培養基中馬鈴薯的匍匐莖較粗大，呈膨大狀態，但很少形成成熟的馬鈴薯（圖2-B）。

圖1 不同糖的種類對馬鈴薯結薯的影響

2.2.2 對馬鈴薯結薯時間的影響 如圖3-A，在35 d、60 d、95 d分別統計結薯量，發現最早結薯的是14號8%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養基，在35 d時結一顆馬鈴薯。

在60 d時添加8%蔗糖的4組培養基都有不同程度的結薯，最多的還是14號結薯0.53個/株；添加5%蔗糖的培養基只有10號5%蔗糖+0.1 mg/L GA+固體培養基結薯0.2個/株；添加3%和1%蔗糖的所有培養基均未有成熟的馬鈴薯。

第95天時，添加3%、5%和8%蔗糖的培養基均有不同程度的結薯，但添加1%蔗糖的4組培養基均未結薯，由于培養基營養有限，植物無法繼續生長，故停止統計。

2.2.3 對馬鈴薯結薯個數的影響 在第95天時統計各組培養基馬鈴薯結薯的情況，無論GA濃度如何，添加1%蔗糖的培養基均未結薯。其他組都有結薯，其中結薯最多的是6號3%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養基，平均1.5個/株。11號5%蔗糖+0.5 mg/L GA+固體培養基，14號8%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養基，16號8%蔗糖+1.0 mg/L GA+固體培養基都達到1個/株以上（圖3-B）。

圖2 同培養基中馬鈴薯的不同部位的外形比較

2.2.4 對馬鈴薯薯重的影響 對馬鈴薯的單薯重和均重進行統計，如圖3-C，均重最大的是6號3%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養基以及9號5%蔗糖+0 mg/L GA+液體培養基，分別是341 mg和342 mg；其次是14號8%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養基和15號8%蔗糖+0.5 mg/L GA+液體培養基，分別重258 mg和226 mg；其他均在120 mg以下。

馬鈴薯薯重的數據比較集中和薯重的均數的趨勢基本符合（圖3-E），6號3%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養基，9號5%蔗糖+0 mg/L GA+液體培養基，14號8%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養基和15號8%蔗糖+0.5 mg/L GA+液體培養基薯重均重大，數據均勻。

統計每組的大薯率（重量大于100 mg），大薯率在60%以上的有：6號3%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養基；9號5%蔗糖+0 mg/L GA+液體培養基；12號5%+1.0 mg/L GA+液體培養基；和15號8%蔗糖+0.5 mg/L GA+液體培養基。5號3%蔗糖+0 mg/L GA+固體培養基和13號8%蔗糖+0 mg/L GA+固體培養基沒有薯重大于100 mg的馬鈴薯。當蔗糖的含量相同時，無論施加GA的含量，液體培養基的薯重都大于固體培養基的薯重（圖3-D）。

圖3 不同培養基對馬鈴薯結薯的影響

3 討論

馬鈴薯塊莖形成的過程是一個十分復雜的過程，據研究有幾種可能的調控途徑都會影響馬鈴薯的結薯過程［6-10］，蔗糖的調控途徑與GA調控途徑的關系也有很多人在探索，Xu［9］和郭春華等［19］認為蔗糖通過影響GA水平來影響馬鈴薯塊莖的形成，郭春華等人提出在試管薯誘導的過程中必須添加高濃度的蔗糖，因為蔗糖會降低赤霉素活性從而促進結薯，而這種赤霉素活性的降低是通過蔗糖與赤霉素結合形成配糖體來實現的。而Ou等［20］發現GA可以影響馬鈴薯液泡酸性轉化酶（vacuolar acid invertase，vacINV）基因啟動子活性，并推測GA可以促進vacINV的表達，促進蔗糖分解從而達到抑制結薯的目的。García等［21］認為蔗糖可能通過調

控ABA應答元件結合蛋白（AREB/ABF）類轉錄因子的表達而參與ABA-GA信號交聯途徑促進結薯。Chincinska等［22］則認為光周期和GA會影響蔗糖運輸蛋白stSUT4的表達，從而影響可能的下游基因stCOL3和stFT的表達和蔗糖的運輸來影響塊莖的形成。由此可見，馬鈴薯塊莖的調控過程是各種調控途徑相互關聯的結果。

表2 正交實驗的極差分析

本實驗通過蔗糖、GA以及培養基類型的三因素的正交試驗選出馬鈴薯試管薯結薯的最優培養基。對實驗結果進行極差分析（表2），3個因素對馬鈴薯結薯數的影響程度大小分別是蔗糖濃度＞GA濃度＞培養基種類，其中培養基種類對馬鈴薯的結薯數幾乎無影響。液體培養基中馬鈴薯在培養基中的匍匐莖呈現膨大狀態（圖1-B），但沒有發育成完整的成熟馬鈴薯。這可能是由于培養瓶空間和培養基營養有限造成的，所以結薯期晚的液體培養基中大多形成膨大的匍匐莖，而未形成馬鈴薯。

對馬鈴薯薯重的影響程度大小分別是培養基種類＞GA濃度＞蔗糖濃度，由于添加1%的蔗糖的培養基未結薯，所以在計算極差時不考慮在內。在圖2-C中，可以明顯的看到液體培養基6號、9號和14號形成的馬鈴薯大于固體培養基5號、10號和13號形成的馬鈴薯。

對馬鈴薯的大薯率的影響程度大小分別是培養基種類＞GA濃度＞蔗糖濃度，但GA濃度和蔗糖濃度對大薯率的影響幾乎無差別。從圖3-D中可以看到，液體培養基的大薯率明顯高于固體培養基。由于在晚結薯的液體培養基中，如7號培養基匍匐莖膨大很明顯但未能形成成熟的馬鈴薯（圖2-B），所以未能得到數量多的馬鈴薯，但是如果給與更多的營養與空間是有可能產生更多的馬鈴薯。

通過對實驗結果的分析發現蔗糖、GA和培養基種類都能影響馬鈴薯的塊莖形成過程。高濃度的蔗糖能夠促使馬鈴薯結薯，這與胡云海［23］，霍鳳蘭等［15］的研究結果一致，但本實驗發現高濃度蔗糖只是縮短了馬鈴薯結薯的時間，并不能增加結薯的總量。液體培養基能夠顯著地提升馬鈴薯的薯重，增大馬鈴薯的大薯率，這與霍鳳蘭［15］，劉玲玲等［24］的結果相同。GA對馬鈴薯結薯的抑制［25］過程也不是絕對的，在蔗糖濃度相同時，在液體培養基中施加低濃度的GA比固體培養基中不添加GA的馬鈴薯結薯多，這可能是由于GA能夠增加馬鈴薯匍匐莖數目，促使匍匐莖伸長，而馬鈴薯塊莖是匍匐莖膨大形成的；液體培養基可能促進了匍匐莖的膨大，所以液體培養基中的匍匐莖數量多，發生膨大，也可以解釋收獲的馬鈴薯大多呈長條狀，所以GA與液體培養基的組合對馬鈴薯塊莖的形成十分有利。但蔗糖和GA在馬鈴薯塊莖形成的具體分子機制還需要進一步研究證明。

通過本實驗的研究得到了使試管薯結薯增多薯重增大的培養基，加快了試管薯的繁育速度，增加了試管薯的體積，解決了利用塊莖作為外植體的馬鈴薯的遺傳轉化的外植體獲得時間長的問題，對馬鈴薯種薯的繁育也有一定的積極意義。

4 結論

本實驗通過設計蔗糖濃度、GA濃度及培養基類型的正交實驗，對馬鈴薯的結薯時間、結薯數量、薯重和大薯率進行統計，得到添加8%蔗糖和0.1 mg/L GA的液體MS培養基能夠使馬鈴薯提前結薯并且得到的馬鈴薯數量多，薯重大。