水楊酸和霜霉病誘導黃瓜PCD過程中線粒體相關基因的表達分析

王丹丹 遲春寧 白晶 陳沖 池春玉，2 丁國華，2

（1. 哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，哈爾濱 150025；2. 植物生物學黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150025；3. 哈爾濱市第六中學，哈爾濱 150036）

水楊酸（SA）是植物產生過敏反應（Hypersensitive Reaction，HR）和系統獲得抗性（Systemic Acquired Resistance，SAR）的內源信號分子，可以誘導抗病基因表達，在植物的SAR信號轉導中起關鍵作用［1］。有很多研究證實SA介導的HR是一個程序性細胞死亡（Programmed cell death，PCD）過程［2-3］。植物發生HR時，常伴隨著特異性信號分子ROS和SA的積累以及染病相關基因（PR）的表達，激發鄰近組織的特異性防御反應和植株的SAR［4］。線粒體在 PCD 中扮演重要角色［5］。線粒體通透性轉運孔（Mitochondria permeability transition pore，MPTP）的開放是PCD中發生的最早事件［6］。MPTP的開放引起線粒體膜電位下降，進一步導致氧化磷酸化作用的解偶聯，膜內外離子濃度趨于平衡，進而導致線粒體外膜被破壞和細胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）的釋放，釋放到胞質內的Cyt C可以激活Caspase等下游關鍵酶類，使信號級聯放大而觸發 PCD［7-8］。Efthimios［9］研究發現鹽脅迫處理煙草植株，短時間鹽脅迫出現線粒體膜去極化、Cyt C釋放和Caspase蛋白含量變化。Janneke［10］研究發現黃瓜子葉在55℃高溫處理，出現DNA梯狀條帶現象，且通過Western blot技術檢測發現Cyt C從線粒體釋放到細胞質中［8］。線粒體中新發現的PCD組分揭示了線粒體在植物中觸發和執行PCD的功能。李家洋研究組通過對mod1抑制基因的研究發現，植物的程序性細胞死亡途徑中存在葉綠體到線粒體的信息交流，蘋果酸-草酰乙酸穿梭途徑在其中發揮關鍵作用。ROS可以作為誘導線粒體膜透化或線粒體通透性轉換孔（MPTP）形成的誘導PCD的信號分子，通過Cyt C的釋放和線粒體電子傳遞鏈（mETC）執行PCD［11］。

目前在水稻、玉米、擬南芥等植物中分離出一些與PCD相關的基因，如與玉米性器官原基退化有關的Ts2基因，大麥中的抗白粉病Mlo基因，擬南芥調控PCD的LSD1基因和與HR反應有關的3個基因AP22A，AP33A和AP43A［12-13］。但植物PCD的研究開展較晚，PCD相關基因的研究遠沒有動物深入，需要分離更多的基因來揭示植物PCD的機制。RNA-seq測序技術是一種轉錄組測序手段，在已完成基因組測序的物種中，通過將RNA-seq結果與基因組DNA序列數據進行比對，從而得到差異表達基因、新基因等［14］。

利用10 mmol/L SA誘導處理黃瓜葉片，檢測到黃瓜發生了PCD，并伴隨著ROS的積累和H2O2產生。獲取黃瓜受SA誘導的PCD相關基因，研究受SA誘導的PCD相關基因與黃瓜抗病的相關性，從中獲取黃瓜抗病相關線粒體基因，為揭示SA誘導黃瓜PCD和提高黃瓜抗病性的分子機制提供基礎。本文根據對RNA-seq測序得到1759個差異表達基因（DEGs）結果進行篩選［15-16］，得到16個與線粒體相關的DEGs。通過qRT-PCR技術分析該16個基因在SA和霜霉病處理下的表達特征，為獲取介導PCD的關鍵基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2016年5月哈爾濱師范大學植物分子生物學實驗室進行。供試黃瓜自交系9930由中國農業科學院蔬菜花卉研究所黃三文教授實驗室贈送。幼苗在光照培養箱內用Hoagland營養液蛭石培養，光照28℃/14 h，黑暗24℃/10 h。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 第4片真葉長出時選長勢良好的黃瓜幼苗在第3片真葉的葉脈間滴加10 mmol/L的SA（每葉4滴，每滴50 μL），并于滴加前（0 h）和滴加后3 h、12 h、24 h取材4次，每次隨機選取3株植株，摘取滴加SA的第3片真葉無菌水洗凈揩干，剪取滴加SA部位混合均勻，提取RNA。

選取霜霉病發病的新鮮葉片，用蒸餾水清洗干凈，放入密封袋，20℃下放置24 h，用毛筆刷取葉片上新長出的孢子囊于無菌水中，制成霜霉菌菌液，濃度為5×105-10×105個孢子囊/mL。采用滴加法接種病菌，選取長勢良好的四葉期黃瓜植株，在第3片真葉的葉脈間滴加菌液，每葉9滴，每滴50 μL，保濕24 h。于滴加前（0 h）和滴加后36 h、72 h和96 h取材4次，每次隨機選取3株植株摘取滴加菌液的第3片真葉無菌水洗凈揩干，剪取接菌部位混合均勻，提取RNA。

1.2.2 qRT-PCR測定 上述保存材料的總RNA提取采用天根生化科技有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（離心柱型），詳細方法見試劑盒說明書。cDNA合成采用寶生物公司的PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒。

根據基因注釋中是否含有mitochondrial，從1759個 DEGs中［12］篩選出 16個基因（表 1）。根據公布的黃瓜基因組基因系列設計出qRT-PCR引物如表1，以18S為內參基因（引物為ATGATAACTCGACGGATCGC和CTTGGATGTGGTAGCCGT），進行qRT-PCR測定。qRT-PCR采用大連寶生物SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，采用 2-ΔΔCT法分析數據，確定基因的相對表達量。

表1 被篩選的16個相關基因及其PCR表達分析引物

2 結果

16個被分析基因的qRT-PCR表達如表2描述，按照基因響應SA和霜霉菌的一致性，可以將這些基因劃分為3類。

第一類基因的表達量在響應SA和霜霉菌上基本一致，都是隨處理時間延長，表達量持續上調，或上調至一定程度后下調，個別下調至處理前水平，且上調幅度都比較大（500%以上）。屬于這類的基因有A、B、F、H、J、L（圖1）。在表達時間段上，H上調響應SA和霜霉菌集中在早期，特別是響應霜霉菌。J上調響應SA在12 h達到最高，響應霜霉菌在36 h最高。L是逐步上調響應SA和霜霉菌，響應SA是12 h達到最大，響應霜霉菌是96 h達到最大。

第二類基因的表達量在響應SA和霜霉菌時雖然一致，但表達量差別很大（圖2）。G和P基因都是上調，但上調幅度都很小，最大為處理前的3倍。I基因顯著響應SA，但上調響應霜霉菌較微弱，而K基因正好相反，上調響應SA很微弱，但響應霜霉菌很強烈，上調幅度最大達到17倍。M基因與K基因相似。

第三類基因在響應SA和霜霉菌上不一致，基本是上調響應SA，下調響應霜霉菌，屬于這類是基因是C、D、E、N和O（圖3）。其中只有N和O基因響應SA的上調表達量較高，最大表達量高于處理前10倍，N響應霜霉菌顯著下調約5倍，而O基本不響應霜霉菌。C、D、E雖然都上調響應SA或下調響應霜霉菌，但響應幅度都不大，約2-3倍。

表2 被篩選的16個相關基因的qRT-PCR表達分析

圖1 qRT-PCR檢測A、B、F、H、J和L基因在滴加SA（（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達分析

圖2 qRT-PCR檢測G、I、K、M和P基因在滴加SA（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達分析

圖3 qRT-PCR檢測C、D、E、N和O基因在滴加SA（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達分析

3 討論

3.1 SA和霜霉病處理黃瓜葉片實時熒光定量PCR表達差異分析

通過實時熒光定量技術分析SA處理和霜霉病處理下，黃瓜葉片的16個線粒體相關基因呈現相似或相悖的表達趨勢，說明SA誘導的PCD相關基因在霜霉病誘導的PCD信號通路中也行使功能。SA與霜霉病對基因表達量的影響具有一定的相似性。其中線粒體丙酮酸載體2（A）、抑制素3（B）、雙磷脂酰甘油脫酰酶（F）、解耦聯蛋白5（G）、線粒體肉堿/酰基肉堿載體（H）、甲酸脫氫酶1（I）、氨基丁酸氨基轉移酶1（J）線粒體內膜轉移酶亞家族（K）、脯氨酸脫氫酶2（L）、丙酮酸脫氫酶E1α（M）和乙酰鳥氨酸轉氨酶（P）11個基因在霜霉病處理中結果與SA處理相似皆為上調。SA與霜霉病對基因表達量的影響也具有一定的差異性，其中3-羥基異丁酰CoA水解酶（C）、分子伴侶60N-2（D）、甘氨酸脫羧酶（E）、延伸因子Tu（O）和亮氨酸拉鏈結構域跨膜蛋白1（N）5個基因在SA處理中為上調表達，在霜霉病處理過程中也為下調表達。按照基因響應SA和霜霉菌的一致性，又可以將這些基因劃分為3類。第一類基因的表達量在響應SA和霜霉菌上基本一致，屬于這類的基因有A、B、F、H、J、L。第二類基因的表達量在響應SA和霜霉菌時雖然一致，但表達量差別很大，屬于這類的基因有G、I、M、K、P。第三類基因在響應SA和霜霉菌上不一致，基本是上調響應SA，下調響應霜霉菌，屬于這類是基因是C、D、E、N和O。說明SA處理下和霜霉病處理下基因的表達存在差異，可能由于SA和霜霉病引發的黃瓜葉片PCD發生方式不同有關。植物類病變（Lesion mimic，LM）又稱類病斑，指在正常生長條件下，即無明顯機械損傷、逆境和外界病原菌侵染，植物的局部或整株上自發產生壞死斑點。這種現象最早在玉米中被發現，隨后大麥、擬南芥、水稻等植物中也相繼報道了該表型的突變體。近年來，隨著多個水稻類病變突變體的陸續發現，水稻類病變基因的定位、克隆及作用機理等方面的研究取得了較大進展。SA參與類病斑的產生，SA誘導的PCD就是一種類病斑，因此研究黃瓜的類病斑或者SA誘導的類病斑，分離和鑒定相關基因，對揭示黃瓜的抗病機制和遺傳育種都有積極意義［17-18］。病原體侵害引發抗病信號途徑有很多種也存在差異，SA處理黃瓜葉片，被侵染部位發生局部壞死（即Hypersensitive response，HR），細胞內ROS的爆發引起PCD的發生，以抵抗病原菌的的進一步擴散；非染病部位則長期保持一種抵抗這種病原和其他病原的抗性即系統獲得抗性［19］。HR和SAR相互作用發生的病原相關蛋白（Patho-genesis related proteins，PRs）基因的表達中增強，引發植物的多種信號轉導途徑。霜霉病是一種病原體的侵害，可以引發植物一系列的防御機制，可以識別損傷細胞的信號分子，引發植物多種信號轉導途徑，最終激活抗脅迫基因的表達［20］。

3.216個線粒體相關基因功能分析

根據基因在SA誘導的黃瓜PCD中的不同表達情況，推測各基因編碼蛋白的功能分為以下5類：參與線粒體信號轉導（甲酸脫氫酶、氨基丁酸氨基轉移酶、抑制素、脯氨酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶）；參與蛋白質合成、折疊和轉運（延伸因子Tu和分子伴侶）；參與線粒體跨膜轉運（線粒體丙酮酸轉運體、解耦聯蛋白、線粒體肉堿/酰基肉堿載體和亮氨酸拉鏈結構域跨膜蛋白1）；參與線粒體呼吸作用的基因（3-羥基異丁酰CoA水解酶和甘氨酸脫羧酶、雙磷脂酰甘油）；乙酰鳥氨酸轉氨酶目前未發現關于在植物線粒體中的研究報道。

脯氨酸脫氫酶ProDH基因在SA和霜霉病處理下均為上調表達，且是隨處理時間延長逐步上調響應，該基因在依賴SA的HR反應，立枯絲核菌侵染綠豆時，脯氨酸積累［21］。研究發現其與SA誘導有關，通過降低ROS含量和增加對病原體的敏感性從而降低擬南芥的細胞死亡率［22］。這證實該基因參與SA和霜霉病誘導的信號途徑，對植物的抗病性起重要作用，可能為誘導植物PCD發生的關鍵基因。

延伸因子Tu和分子伴侶在SA和霜霉病的處理下呈相反的趨勢，說明在植物PCD的過程中，參與蛋白質合成折疊和轉運的基因表達呈復雜變化趨勢，可能抑制或促進。延伸因子Tu（EF-Tu）存在于及植物的線粒體細胞內，是在mRNA翻譯時促進多肽鏈延伸的蛋白質因子。高溫、干旱、低溫以及病原菌侵入等因素可以誘導EF-Tu基因的表達，提高植物的耐熱、耐旱及抗病性。研究發現在非生物脅迫下，植物體中EF-Tu的表達上調，表明在脅迫過程中EF-Tu基因有重要作用［23］。在高溫和干旱脅迫下，玉米的EF-Tu合成和積累增加。

線粒體內膜轉移酶基因在SA中呈上調趨勢，而在霜霉病處理下呈下降趨勢。該基因在脅迫處理下可以通過基因的調控減小植物在脅迫下的損傷，說明研究在植物PCD過程中線粒體跨膜轉運的基因作用有重要意義。線粒體丙酮酸轉運體（MPC）存在于線粒體內膜，可以介導丙酮酸由細胞質內進入線粒體，是其進行三羧酸循環的重要一步；為脂肪酸、酮類和膽固醇的合成提供醋酸鹽［24］。現已發現在干旱脅迫下煙草MPC基因通過調節ABA的釋放，影響保衛細胞跨膜離子轉運及氣孔運動，提高煙草的抗旱性［25］。

3-羥基異丁酰CoA水解酶（HIBCH）和甘氨酸脫羧酶（GLDC），在SA和霜霉病處理下呈相反的趨勢，而雙磷脂酰甘油（CL）基因呈相似的上調表達趨勢。雙磷脂酰甘油（CL）是一種二聚的磷脂，可以參與線粒體呼吸作用和電子傳遞鏈，與線粒體的功能和結構有關［26］。研究發現線粒體中的CL基因可以參與細胞氧化磷酸化和細胞凋亡過程［27］。

綜上，被研究的16個基因中線粒體丙酮酸載體2（A）、抑制素3（B）、雙磷脂酰甘油脫酰酶（F）、線粒體肉堿/酰基肉堿載體（H）、氨基丁酸氨基轉移酶1（J）、脯氨酸脫氫酶2（L）等6個基因在響應SA和霜霉病處理時都是上調表達，顯示這些基因在SA誘導的PCD過程中承擔一定的功能；而3-羥基異丁酰CoA水解酶（C）、分子伴侶60N-2（D）、甘氨酸脫羧酶（E）、延伸因子Tu（O）和亮氨酸拉鏈結構域跨膜蛋白1（N）等5個基因在SA處理中為上調表達，在霜霉病處理中卻是下調表達，可以推斷這些基因在響應SA時所起的作用與霜霉菌引起的病變關系不密切；另外5個基因解耦聯蛋白5（G）、甲酸脫氫酶1（I）、線粒體內膜轉移酶亞家族（K）、丙酮酸脫氫酶E1α（M）、和乙酰鳥氨酸轉氨酶（P）等雖然響應SA和霜霉菌比較一致，但表達量的上調幅度很小，難以說明在黃瓜SA誘導的PCD過程中與霜霉菌引起的HR反應中起相似的作用。

4 結論

本文通過qRT-PCR技術分析16個線粒體相關基因的表達動態，在SA和霜霉病處理均表達，其中11個基因在響應SA和霜霉菌上一致，5個基因不一致。說明SA和霜霉病誘導PCD具有相似性和差異性。16個基因參與線粒體膜轉運、細胞呼吸作用、蛋白質合成、折疊和轉運、線粒體信號轉導等過程。證實了在線粒體發生PCD過程中與這16個基因有密切關系。