松杉靈芝發酵菌絲對CCl4誘導的小鼠肝纖維化保護作用研究

王淑敏，穆雙雙，王 方，曹 菁

（長春中醫藥大學，長春 130117）

各種原因引起的肝細胞變性壞死及炎癥，在壞死區出現細胞外基質（ECM）的沉積，初期增生的纖維組織尚未形成假小葉，稱為肝纖維化(HF ) ，為可復性病變。當肝損傷長時間存在，肝臟中多種 ECM 異常聚集，進一步纖維化，會逐漸發展為肝硬化，誘發肝功能衰竭和肝癌[1-2]。而肝星狀細胞（HSC）是 ECM 的主要形成細胞，HSC的活化被認為是肝纖維化過程中的關鍵環節[3]。HSC的激活與多種細胞因子密切相關，如轉化生長因子β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（ⅠL-6）等[3]。TGF-β一直被視為活化肝星狀細胞的主要細胞因子，TGF-β主要是通過TGF-β/Smad信號轉導通路發揮效應。現已證明許多中草藥和食藥用真菌具有肝保護作用和抗肝纖維化作用[3-5]。松杉靈芝（Ganodermats tsugae Murr.）為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬藥用真菌, 分布于黑龍江、吉林、甘肅等省,民間多當靈芝入藥, 具有扶正固本, 滋補強壯等功效。具有增強脾臟NK細胞活性、促血漿ⅠFN因子生成及保肝、抗腫瘤和增強細胞免疫效應的作用[6-7]。但松杉靈芝抗肝纖維化的作用在國內外文獻報道鮮見，本文重在探討松杉靈芝發酵菌絲抗CCl4引起的小鼠肝纖維化損傷作用及其作用機制。

1 材料

松杉靈芝發酵菌絲由長春中醫藥大學藥用真菌研究室提供。SPF級C57小鼠50只，6～8周齡，體質量18～22 g，雌性，購自長春億斯實驗動物技術有限責任公司。動物批準文號：SCXK（吉）2010-0009。CCl4、 橄 欖 油、ALT、AST、SOD、MDA、TNF-α、ⅠL-6均購自南京建成生物有限公司；CCl4油液臨用前溶于橄欖油配成20%的濃度。麥角甾醇對照品購于中國藥品生物制品檢定所（批號：MUST－11070601），甲醇為色譜純（美國 Fisher 公司），為超純水（18.2ΩPa），其他試劑均為分析純。LC－20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；全自動多功能酶標儀（芬蘭雷勃）；垂直電泳（國美伯樂）；生物顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 色譜條件 漢邦ODS－C 18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動相甲醇，檢測波長282 nm，流速 1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。理論塔板數以麥角甾醇峰計不得少于 3 000。色譜圖見圖 1～2。

圖1 麥角甾醇標準品 HPLC 圖

圖2 松杉靈芝菌絲體 HPLC 圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取麥角甾醇對照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得（0.1 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 準確稱取樣品（松杉靈芝菌絲體）0.5 g置干燥具塞的三角瓶中，加入10 mL甲醇，精密稱定重量，超聲提取 1 h，放至室溫，稱重，補加甲醇至原重量，濾過，取續濾液過0.45 μm濾膜，即得到供試品溶液備用。

2.3 肝纖維化模型建立及給藥 C57小鼠分為對照組肝纖維化模型組和松杉靈芝發酵菌絲治療組，每組各10只，將小鼠腹腔注射20 % CCl4（2 mL/kg），用橄欖油（1:4）稀釋， 每周2次，持續6周，形成穩定的肝纖維化動物模型[8-9]。從造模第5周開始采用松杉靈芝發酵菌絲0.5 g/kg和1 g/kg灌胃給藥14 d，對照組給予等體積的橄欖油，直至6周實驗結束時停止給藥。實驗結束后，小鼠經麻醉后，收集血清和肝臟標本，一部分肝臟用10 %的福爾馬林固定，石蠟包埋，另一部分肝臟標本采用液氮速凍并置于- 80 ℃保存待用。

2.4 指標檢測

2.4.1 樣品中麥角甾醇含量測定 取松杉靈芝菌絲體粉末，按 “2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品中麥角甾醇的含量，結果為3.29 mg/g。

2.4.2 血清學肝功能測定 取小鼠血液約0.3 mL，置干燥玻璃管內，37 ℃保溫30 min，4 ℃冰箱靜置2 h，2 000 min，離心10 min，取血清，- 80 ℃保存自動生化分析儀檢測肝功能指標ALT和AST。

2.4.3 血清中 ⅠL-6、TNF-α 檢測 血清中 ⅠL-6、TNF-α檢測方法按照試劑盒方法進行檢測。

2.4.4 肝臟組織SOD、MDA檢測 取小鼠肝組織，用生理鹽水1:9進行勻漿，按照SOD、MDA試劑盒說明書進行檢測。

2.4.5 HE染色 小鼠肝組織經10%中性緩沖甲醛液固定、取材、乙醇梯度脫水、石蠟包埋切片，作HE染色觀察肝纖維化程度。

2.4.6 Western blot 將肝組織置于冰冷的裂解液收集裂解物總蛋白，組織蛋白行SDS-PAGE并轉印至PVDF膜； 室溫封閉2 h，分別與TGF-β抗體、Smad-3抗體、p-Smad-3抗體、MMP3抗體、MMP9抗體一抗孵育，膜經漂洗后再與辣根過氧化物酶偶聯的二抗反應，增強化學發光法（ECL）發光試劑顯影，灰度成像軟件（UVP，UK）測定主帶的光密度值以計算TGF-β、Smad-3、p-Smad-3、MMP3、MMP9蛋白表達水平。

2.5 統計學分析 實驗數據結果以均數±標準差（x±s）表示，用Graphpad Prism 5.0統計軟件對多組比較用單因素方差分析。

3 結果

3.1 松杉靈芝發酵菌絲減輕CCl4誘導的小鼠肝臟病理損傷 空白組肝臟肝細胞索排列較整齊，未見水樣變性及脂肪變性，未見纖維結締組織增生及假小葉形成，枯否氏細胞未見增生, 毛細血管及匯管區內膽管未見膽汁淤積，匯管區未見纖維組織增生及炎性細胞浸潤。模型組肝臟均可見肝細胞水樣變性、肝細胞脂肪變性和壞死、炎細胞浸潤，纖維結締組織增生，增生的纖維組織將肝組織分成廣泛的假小葉。松杉靈芝發酵菌絲治療組能顯著改變上述病理改變。結果見圖3。

圖3 松杉靈芝發酵菌絲對CCl4 誘導的小鼠肝臟病變的影響（HE，×100）

3.2 松杉靈芝發酵菌絲對肝臟纖維化小鼠血液AST、ALT的影響 與空白組相比，肝纖維化模型組血清AST和ALT顯著增高（P＜0.01）；給予松杉靈芝發酵菌絲治療后血清AST和ALT顯著降低（P＜0.01，表1）。

3.3 松杉靈芝發酵菌絲對肝臟纖維化小鼠肝臟SOD、MDA的影響 與空白組相比，肝纖維化模型組的肝臟SOD顯著降低、MDA顯著增高（P＜0.01）；給予松杉靈芝發酵菌絲治療后肝臟SOD顯著增高、MDA顯著降低（P＜0.01，表2）。

3.4 松杉靈芝發酵菌絲對肝臟纖維化小鼠血清ⅠL-6、TNF-α 的影響 與空白組相比，肝纖維化模型組血清ⅠL-6和TNF-α顯著增高（P＜0.01）；給予松杉靈芝發酵菌絲治療后血清ⅠL-6和TNF-α顯著降低（P＜0.01，表3）。

表1 松杉靈芝發酵菌絲對 AST 和ALT 的影響（x± s ，n = 10）

表2 松杉靈芝發酵菌絲對 SOD 和MDA 的影響（x± s，n = 10）

表3 松杉靈芝發酵菌絲對ⅠL-6 和TNF-α 的影響（x± s ，n = 10）

3.5 松杉靈芝發酵菌絲對TGF-β、Smad-3、p-Smad-3、MMP3、MMP9表達的影響 與空白組相比, 肝纖維化模型組的肝臟TGF-β、p-Smad-3、MMP3、MMP9蛋白水平顯著升高（P＜0.01），Smad-3蛋白水平無明顯變化（P＞0.05）；給予松杉靈芝發酵菌絲治療后肝組織中TGF-β、p-Smad-3、MMP3、MMP9蛋白水平降低（P＜0.01），Smad-3蛋白水平無明顯變化（P＞0.05），結果見圖4及表4。

表4 藥物對TGF-β、Smad-3、p-Smad-3、MMP3、MMP9的影響（x± s ，n = 3）

圖4 肝組織中TGF-β、Smad-3、p-Smad-3、MMP3、MMP9蛋白水平

4 討論

CCl4誘導的肝纖維化動物模型其病理改變與人類肝纖維化的形態特征相似，本實驗在皮下連續注射CCl4后，模型組小鼠肝細胞腫脹，部分肝細胞變性和壞死，炎細胞浸潤，纖維結締組織增生，增生的纖維組織將肝組織分成廣泛的假小葉，提示模型復制成功。松杉靈芝發酵菌絲干預后，小鼠肝纖維化程度明顯好轉，提示松杉靈芝發酵菌絲對小鼠肝纖維化具有一定的保護作用。

肝功能的改變可以反映肝臟的炎癥，肝細胞變性、壞死的程度。肝纖維化與肝細胞的損傷密切相關，肝細胞壞死或細胞膜受損后，細胞膜通透性增高以及線粒體受到損傷，細胞中轉氨酶進入血清增多，通過測定血液中ALT和AST 可反映肝臟的受損情況[10]。實驗結果發現，與模型組相比，給藥組能夠降低血清中ALT、AST 的含量，說明松杉靈芝發酵菌絲能明顯改善小鼠肝臟受損的程度。

機體內氧化自由基過剩，會引起脂質過氧化反應，并形成脂質過氧化反應產物—MDA，MDA與蛋白質、核酸等生物大分子結合形成脂褐質沉積于細胞中，造成細胞損傷。SOD是生物體內清除自由基的首要物質，是催化清除自由基的重要酶類，它可阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害。松杉靈芝發酵菌絲能顯著能提高肝纖維化小鼠血清中SOD水平，降低MDA水平，提示松杉靈芝發酵菌絲可通過催化SOD活性清除機體過量的氧自由基，抑制脂質過氧化反應而起到保護肝臟作用的。

ⅠL-6、TNF-α作為重要的促炎細胞因子，其大量合成與釋放會造成炎癥反應。TNF-α能加強HSC的趨化性，促進HSC增生，并可通過刺激肝臟炎癥反應的產生間接發揮促纖維化作用；ⅠL-6可刺激HSC增殖和?膠原合成，使HSC呈持續活化狀態，促進肝纖維化的形成[11-13]。本研究中，給予松杉靈芝發酵菌絲干預后，可明顯抑制ⅠL-6、TNF-α的表達，對CCl4誘導的小鼠肝纖維化具有一定的保護作用，其機制可能與下調促炎因子，抑制星狀細胞（HSC）的活化，減少肝內彌漫性細胞外基質（ECM）過度沉淀有關。

肝纖維化的本質是肝臟中ECM的過度沉積，TGF-β是促纖維化主要細胞因子之一，TGF-β可通過促進HSC合成Ⅰ型、Ш型、ⅠV型膠原等增加ECM的合成。TGF-β是Ⅰ型膠原基因轉錄刺激因子，當TGF-β與其受體結合后激活Smad-3并磷酸化，與Smad-4形成異源三聚體復合物入核，與DNA結合，調控Ⅰ型膠原基因的轉錄和表達，使肝組織纖維化[14-15]。實驗證明，松杉靈芝發酵菌絲是通過下調TGF-β和抑制Smad-3磷酸化，阻斷TGF-β/ Smad信號轉導通路，降低Ⅰ型膠原基因的轉錄和表達；起到抗肝組織纖維化作用。

Seydel等在非酒精性脂肪肝體外實驗研究中，發現在人肝星狀細胞株XL-2細胞中維生素D2明顯抑制了游離脂肪酸（FFA）誘導的TGF-β和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達，表現出維生素D2抗纖維化的作用[16]。松杉靈芝發酵菌絲中含有大量的麥角甾醇成分，麥角甾醇是一種重要的原維生素D，經紫外光照射能轉化成為維生素D2。因此推測松杉靈芝發酵菌絲抗肝組織纖維化作用是所含麥角甾醇轉化成維生素D2，下調了TGF-β和α-SMA的表達而起到抗肝纖維化作用。

MMPs是一組降解ECM的最主要的酶系，參與細胞外基質成分的降解，能特異性降解變性膠原、基底膜、Ⅰ型膠原及彈性蛋白，破壞基底膜、促進炎癥過程中有關細胞的遷移以及ECM重建[17]。松杉靈芝發酵菌絲使肝組織MMP-3和MMP-9表達下調，可阻止肝纖維化和壞死細胞極度遷移增生，可有效控制肝組織的纖維化。

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，實驗表明，松杉靈芝發酵菌絲可通過改善小鼠肝功能；清除機體過量的氧自由基，抑制脂質過氧化反應；下調促炎因子，抑制星狀細胞（HSC）的活化；通過TGF-β/ Smad-3信號轉到通路，下調TGF-β而抑制Smad-3磷酸化，降低?型膠原基因的轉錄和表達；通過所含的麥角甾醇轉化成維生素D2，下調TGF-β和α-SMA的表達；下調肝組織MMP-3和MMP-9表達，止肝纖維化和壞死細胞極度遷移增生等多方面共同作用而起到抗纖維化作用。提示人們可以利用工業化發酵技術生產其發酵物，開發具有預防和治療肝纖維化的保健食品或藥品。