白虎加人參湯對糖尿病大鼠氧化應激水平及TRPV1mRNA基因表達的影響

劉影哲，王春曉，潘祥賓

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，哈爾濱 150040）

氧化應激是機體受到多種有害刺激時，氧化與抗氧化系統失衡產生的一種反應，可導致組織損傷，與糖尿病的發生及發展密切相關。TRPV1離子通道參與了降糖，減輕胰島素抵抗及糖尿病的神經和血管并發癥。本實驗通過研究白虎加人參湯對糖尿病大鼠DRG中TRPV1mRNA基因水平的影響，探討白虎加人參湯對糖尿病神經病變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 45只清潔級健康雄性SD大鼠，體質量（220±10）g，購自于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（黑）2013-004。白虎加人參湯由生曬參、石膏、知母、甘草、梗米組成，中藥飲片及煎劑由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院煎藥室完成。α-硫辛酸注射液：重慶藥友制藥有限公司。鏈腺佐菌素（STZ）：美國Sigama公司，總抗氧化力（TAOC）試劑盒北京博奧森生物技術有限公司。Real-time PCR 試劑盒TaKaRa 公司code

DRR420A。

引物名稱 引物序列（5’to3’） 產物大小（bp）TRPV1-F CACCTTGCTGTCACCCTGTT 181 TRPV1-R CGTTCTCCGTGGTGTTCCTT βactin-F ACTCTGTGTGGATTGGTGGC 155 βactin-R AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC

1.2 糖尿病大鼠模型的制備及分組 健康SD大鼠45只，隨機取10只作為正常對照組，其余35只按照50 mg/kg的劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，72 h后檢測大鼠尾靜脈血糖，≥16.7 mmoL作為糖尿病大鼠造模成功標準。將造模成功大鼠31只，隨機分為模型組11只，白虎加人參湯組10只，硫辛酸組10只。中藥組以9.38 g/（kg·d）灌胃。α-硫辛酸組予20 mg/（kg·d）劑量腹腔注射給藥。正常對照組與模型對照組予等體積的生理鹽水灌胃。

1.3 觀察指標 一般狀態，總抗氧化力（TAOC）測定，大鼠背根神經節TRPV1mRNA基因的檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 一般狀態 正常對照組大鼠精神狀態良好；模型對照組大鼠進食、飲水量增加明顯，反應遲鈍。兩治療組大鼠有類似模型組的表現，但程度較輕，精神狀態尚可，活動尚靈活。正常對照組大鼠死亡1只，模型對照組死亡3只，白虎加人參湯組死亡2只，α-硫辛酸組死亡3只。

2.2 各組大鼠TAOC及背神經根TRPV1mRNA表達的比較（見表1，圖1） 表1顯示，與正常對照組比較，模型對照組、白虎加人參湯組、α-硫辛酸組總抗氧化能力明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型對照組比較，白虎加人參湯組和α-硫辛酸組總抗氧化能力均升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；α-硫辛酸組與白虎加人參湯組比較總抗氧化能力增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型對照組、白虎加人參湯治療組、α-硫辛酸治療組的背根神經節的TRPV1mRNA的表達升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，白虎加人參湯組和α-硫辛酸組的TRPV1mRNA的表達下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠TAOC及TRPV1 mRNA水平變化（x± s ）

圖1 TRPV1mRNA電泳圖

3 討論

白虎加人參湯既可清陽明之熱，又能益氣生津，臨床應用可明顯減輕消渴病患者“三多一少”及倦怠乏力等癥狀。前期實驗研究表明，白虎加人參湯具有抗氧化應激的作用，在降低血糖的同時還可以防治糖尿病并發癥的發生和進展。2001年Brownlee等[1]提出，引發糖尿病并發癥的途徑是高血糖環境下線粒體內電子傳遞鏈過氧化物產生過量導致的結果。反應氧化應激的指標包括MDA、TAOC、SOD、GSH等。胰島β細胞內的SOD、GSH等的抗氧化物的含量較其他組織低，所以易受到活性氧等物質的損傷誘發氧化應激，使得受到葡萄糖刺激的胰島β細胞分泌胰島素減少，產生和加重糖尿病[2-3]。血清TAOC可以評價體內非酶類和酶類抗氧化物的總體水平，能夠清除過高的活性氧，使機體處于氧化還原相對平衡狀態[4]。

有研究表明，糖尿病患者中約30%～50%患者會出現糖尿病神經病變（DPN），其中大于20%的患者發展為糖尿病神經性疼痛（DNP）[5]。在早期DPN患者中，約71%會出現機械痛敏（壓迫痛）[6]，晚期感覺缺失加重，最終發展成糖尿病足[7-8]。TRPV1感受器參與了內分泌、免疫、消化、神經等多個系統疾病的發生。并參與了神經病理性痛[9]、偏頭痛[10]和癌性痛[11]等多種疼痛的發生發展。美國Andrei V.Derbenev教授于 2015 年 9 月份發表了一篇關于TRP 通道在治療糖尿病疾病中重要作用的綜述，指出其可以改善胰島功能，并對 TRPV1做了詳細論述。日本自然科學院的Kunitoshi Uchida 教授指出TRP 離子通道在保護β細胞功能方面扮演著重要角色。在糖尿病狀態下，TRPV1 是熱痛及痛覺的關鍵因子[12]，能夠將傷害性的刺激傳輸至中樞神經系統中，誘導周圍神經末梢釋放促炎神經肽及ⅠL-1β、TNF-a因子[13]和生長抑素[14]。同時，有研究表明，在組織損傷和發生炎癥之后，感覺神經元中TRPV1蛋白的表達量會增加[15]，參與疼痛的傳遞。中藥四氣中的寒、熱、溫、涼和中醫寒熱體質與TRP 通道存在一定關系[16-18]。姜黃素、肉桂醛等中藥有效成分均可影響TRPV1 通道的表達[19-20]。本研究結果表明，白虎加人參湯可以下調TRPV1mRNA的表達，提出白虎加人參湯可能通過抗氧化應激，進而下調TRPV1mRNA的表達，其作用機制是否與組成藥物的寒熱屬性相關有待于下一步的研究。