白虎加人參湯對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激水平及TRPV1mRNA基因表達(dá)的影響

劉影哲，王春曉，潘祥賓

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150040）

氧化應(yīng)激是機(jī)體受到多種有害刺激時(shí)，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡產(chǎn)生的一種反應(yīng)，可導(dǎo)致組織損傷，與糖尿病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。TRPV1離子通道參與了降糖，減輕胰島素抵抗及糖尿病的神經(jīng)和血管并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究白虎加人參湯對(duì)糖尿病大鼠DRG中TRPV1mRNA基因水平的影響，探討白虎加人參湯對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 45只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220±10）g，購(gòu)自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑）2013-004。白虎加人參湯由生曬參、石膏、知母、甘草、梗米組成，中藥飲片及煎劑由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院煎藥室完成。α-硫辛酸注射液：重慶藥友制藥有限公司。鏈腺佐菌素（STZ）：美國(guó)Sigama公司，總抗氧化力（TAOC）試劑盒北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Real-time PCR 試劑盒TaKaRa 公司code

DRR420A。

引物名稱 引物序列（5’to3’） 產(chǎn)物大小（bp）TRPV1-F CACCTTGCTGTCACCCTGTT 181 TRPV1-R CGTTCTCCGTGGTGTTCCTT βactin-F ACTCTGTGTGGATTGGTGGC 155 βactin-R AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC

1.2 糖尿病大鼠模型的制備及分組 健康SD大鼠45只，隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組，其余35只按照50 mg/kg的劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，72 h后檢測(cè)大鼠尾靜脈血糖，≥16.7 mmoL作為糖尿病大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)。將造模成功大鼠31只，隨機(jī)分為模型組11只，白虎加人參湯組10只，硫辛酸組10只。中藥組以9.38 g/（kg·d）灌胃。α-硫辛酸組予20 mg/（kg·d）劑量腹腔注射給藥。正常對(duì)照組與模型對(duì)照組予等體積的生理鹽水灌胃。

1.3 觀察指標(biāo) 一般狀態(tài)，總抗氧化力（TAOC）測(cè)定，大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1mRNA基因的檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好；模型對(duì)照組大鼠進(jìn)食、飲水量增加明顯，反應(yīng)遲鈍。兩治療組大鼠有類似模型組的表現(xiàn)，但程度較輕，精神狀態(tài)尚可，活動(dòng)尚靈活。正常對(duì)照組大鼠死亡1只，模型對(duì)照組死亡3只，白虎加人參湯組死亡2只，α-硫辛酸組死亡3只。

2.2 各組大鼠TAOC及背神經(jīng)根TRPV1mRNA表達(dá)的比較（見(jiàn)表1，圖1） 表1顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、白虎加人參湯組、α-硫辛酸組總抗氧化能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，白虎加人參湯組和α-硫辛酸組總抗氧化能力均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；α-硫辛酸組與白虎加人參湯組比較總抗氧化能力增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、白虎加人參湯治療組、α-硫辛酸治療組的背根神經(jīng)節(jié)的TRPV1mRNA的表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，白虎加人參湯組和α-硫辛酸組的TRPV1mRNA的表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠TAOC及TRPV1 mRNA水平變化（x± s ）

圖1 TRPV1mRNA電泳圖

3 討論

白虎加人參湯既可清陽(yáng)明之熱，又能益氣生津，臨床應(yīng)用可明顯減輕消渴病患者“三多一少”及倦怠乏力等癥狀。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，白虎加人參湯具有抗氧化應(yīng)激的作用，在降低血糖的同時(shí)還可以防治糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展。2001年Brownlee等[1]提出，引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的途徑是高血糖環(huán)境下線粒體內(nèi)電子傳遞鏈過(guò)氧化物產(chǎn)生過(guò)量導(dǎo)致的結(jié)果。反應(yīng)氧化應(yīng)激的指標(biāo)包括MDA、TAOC、SOD、GSH等。胰島β細(xì)胞內(nèi)的SOD、GSH等的抗氧化物的含量較其他組織低，所以易受到活性氧等物質(zhì)的損傷誘發(fā)氧化應(yīng)激，使得受到葡萄糖刺激的胰島β細(xì)胞分泌胰島素減少，產(chǎn)生和加重糖尿病[2-3]。血清TAOC可以評(píng)價(jià)體內(nèi)非酶類和酶類抗氧化物的總體水平，能夠清除過(guò)高的活性氧，使機(jī)體處于氧化還原相對(duì)平衡狀態(tài)[4]。

有研究表明，糖尿病患者中約30%～50%患者會(huì)出現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病變（DPN），其中大于20%的患者發(fā)展為糖尿病神經(jīng)性疼痛（DNP）[5]。在早期DPN患者中，約71%會(huì)出現(xiàn)機(jī)械痛敏（壓迫痛）[6]，晚期感覺(jué)缺失加重，最終發(fā)展成糖尿病足[7-8]。TRPV1感受器參與了內(nèi)分泌、免疫、消化、神經(jīng)等多個(gè)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。并參與了神經(jīng)病理性痛[9]、偏頭痛[10]和癌性痛[11]等多種疼痛的發(fā)生發(fā)展。美國(guó)Andrei V.Derbenev教授于 2015 年 9 月份發(fā)表了一篇關(guān)于TRP 通道在治療糖尿病疾病中重要作用的綜述，指出其可以改善胰島功能，并對(duì) TRPV1做了詳細(xì)論述。日本自然科學(xué)院的Kunitoshi Uchida 教授指出TRP 離子通道在保護(hù)β細(xì)胞功能方面扮演著重要角色。在糖尿病狀態(tài)下，TRPV1 是熱痛及痛覺(jué)的關(guān)鍵因子[12]，能夠?qū)π缘拇碳鬏斨林袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中，誘導(dǎo)周圍神經(jīng)末梢釋放促炎神經(jīng)肽及ⅠL-1β、TNF-a因子[13]和生長(zhǎng)抑素[14]。同時(shí)，有研究表明，在組織損傷和發(fā)生炎癥之后，感覺(jué)神經(jīng)元中TRPV1蛋白的表達(dá)量會(huì)增加[15]，參與疼痛的傳遞。中藥四氣中的寒、熱、溫、涼和中醫(yī)寒熱體質(zhì)與TRP 通道存在一定關(guān)系[16-18]。姜黃素、肉桂醛等中藥有效成分均可影響TRPV1 通道的表達(dá)[19-20]。本研究結(jié)果表明，白虎加人參湯可以下調(diào)TRPV1mRNA的表達(dá)，提出白虎加人參湯可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激，進(jìn)而下調(diào)TRPV1mRNA的表達(dá)，其作用機(jī)制是否與組成藥物的寒熱屬性相關(guān)有待于下一步的研究。